海绵共附生微生物基因多态性的RAPD-PCR分析

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海绵共附生微生物基因多态性的 R D.CR分析 AP P李志勇，秦思昊，何丽明，黄艳琴(上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室，上海 2 0 4 ) 0 2 0

摘要：采用传统分离手段对中国南海海域的细薄星芒海绵(tH a tn i( id rn 19 )、 Se e a e u Ln Be, 8 7 1 皱皮软海绵 (Hai o di u oa ( de& Ded )、澳大利亚厚皮海绵 ( rnel l h n r rg s Ril c a y n y) C ai a l a s ai s C r r、贪婪倔海绵 ( yie v r Sh d) ut l ni at ) r e s( e ) D sdaaaa(c mit4种海绵体内的微生物进行了 )

分离培养，随机挑选 6株芽孢杆菌属细菌 ( 4每种海绵 1株 ) 6进行了 R P .C A D P R基因多态 性分析。研究表明，一些海绵微生物是可以通过传统分离手段得到的，来自同一或者不同海绵的微生物均具有丰富的基因多态性。关键词：海绵；芽孢杆菌；R P P R;聚类分析 A D.C中图分类号：Q 3 9文献标识码：A 文章编号：1 0 -O 62 0 )7o 1-6 0 03 9 (o 6O -0 5O

海绵以其独特的腔状结构和依靠过滤海水而获究。

得营养的方式使其成为海洋微生物良好的宿丰I I 1。大量研究证实海绵化合物具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、 扩张心血管、增强免疫力、酶抑制、抑制细胞分裂等功卜。自从 19 9 5年以来，从海绵中分离到的活性物质与从其他所有海洋生物中发现的活性物质相当， 海绵也因此而成为许多国家开发海洋新药研究的热点。目前海洋活性物质来源已经成为限制海洋药物开发的瓶颈问题。一些国外的研究表明，海绵的活性物质可能来自于其体内的微生物[ 1,使海绵微生物研 80￣】

作者首先采用传统的微生物分离纯化手段对中国 4种南海海绵进行微生物分离培养，利用 R P .C A D P R基因多态性技术对 6 4株芽孢杆菌的基因多样性进行研究，目的是从基因水平对中国南海海绵的微生物多样性进行初步揭示，为结合其他手段 (例如 P R D E、FS C . GG IH、透射电子显微镜 )全面了解海绵共附生微生物多样性信息奠定基础。

l材料与方法1 . 1海绵样品采集自中国海南

周边 5 Om海域，中国科学~2经院海洋研究所李锦和研究员鉴定为：细薄星芒海绵 Se ea e u ( id rn 8 7)皱皮软海绵 tHt t i Ln ge,1 9、 t n H l h n r g s Rde ai o d i r oa( il c au y&De d ) n y、澳大利亚厚皮

究显得更为重要和迫切，中海绵体内丰富微生物多其样性的揭示是最基础的科学问题。 2 O世纪 8代以来，中国已经针对海绵的化学 O年成分、活性进行了比较多的研究【。2 0年国内” 02 开始进行海绵微生物的研究，但在海绵微生物多样性揭示方面的研究非常欠缺，有待开展。 分子技术在微生物多样性的揭示方面已显示了 传统的生理、生化和形态学研究方法不具有的优势。 其中，随机扩增的多态性分析 ( AP R D:R n o a d mA l e o mop i D mpi d P l rhc NA )可以在对对象基因信 i f y

海绵 C a i l ut l n i C r r、贪婪掘海绵 rne a a s ai s l r e s( at ) eD s e vr S h d) y i aa aa(cmi。 d t

收稿日期：2 0 .01;修回日期：2 0.21 0 31-0 040.0基金项目：国家 83计划资助项目 ( 02 A6 88 6 2 0A 20 0。

息没有任何了解的前提下运用随机引物扩增寻找多态性 DNA片段作为分子标记而初步揭示不同菌落的

20 A 20 0;上海市科技启明星资助项目 (4 MXI 1 ) 04 A6 86 ) 0Q 4 1作者简介：李志勇 (9 9),男 ( 16 .回族 )。河南信阳人，教授。博士，主要从事海绵共附生微生物方面的研究，电

分类关系【】 ,非常适合复杂的海绵微生物多样性研话： 1324 3￣Ema: l j . u a 0 -4 00 6— iz i te . 2 l y@su d cMaieS in e/ 1 0No./0 6 rn ce csVo., 72 0 3 1 5

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1 . 2海绵微生物的分离无菌条件下用无菌水冲洗掉海绵表面附生的微生物，剖开海绵从内部切取海绵小块并切成 1 的 mm碎块，直接在 F L培养基和 C mi . x培养基[J 1平板上划 4

引物 2 . G T GT T T C .,:5T T C GC G T GT3引物 3 5AG .: - C

G C AA 3 0u GG C .。5 L的 P R反应体系：模板 D C NA 6、

随机引物 5 L、1x C u e5、d T v 0 P RB f r N P1

、

Tq酶 2最后加 dI2至 5 。采用 P R仪 a U d-O - I 0 C ( B D)按照以下程序进行扩增： 9 HY AI 4℃预变性 2ri,然后进入以下循环：4℃ 1 n 3℃ 1 i, an 9 , 6 n mi a r7 2℃ 2 i, 4轮循环。环结束后， 2℃ 1 ai, a rn共 5循 7 0r n

线，置于生化培养箱 2 0℃培养 1,挑取单菌落。周同时，将上面获得的海绵碎块置于装有 5 0mL无菌人工海水【J l的锥形瓶中 2 5 0℃彻底分散使体内微生物释

放出来，取 1~1~ 1一1 1~1 1~1。稀释液 4℃保存。以上试剂除 Tq酶为上海申能博彩生物科 0,O,,,0,0,,0 0 0 0 a O5 .mL分别在 F L培养基平板上涂布，0℃培养 1, 2周挑取单菌落。将以上两种方法得到的单菌落连续两次划线得到纯化的菌株，平板 4℃保存。从分离到的微技有限公司产品外均由上海生工生物技术有限公司提供。

取 P R产物 5V C L加 3v - L上样缓冲液(X和 4 6)

生物中选择芽孢杆菌属细菌，随机挑选 6株进行 d H2于 1%琼脂糖胶上电泳，稳压 8 V。采用 4 d O . 5 0 R D.C AP P R分析基因多态性。菌株编号方法如下：以式进行菌株编号，例如 S 1表示从细薄星芒海绵中分离到的 1号菌株。 T n nGI外凝胶成像处理系统观察、拍照。采用 a o S紫获得一个相似度矩阵，用最短距离法对泳道进行聚类分析，获得各泳道的相似程度，以此绘制聚类图。海绵拉丁文名称第一个字母置前、阿拉伯数字居后方 GI S软件对所有泳道进行两两配对，计算欧氏距离，

13基因组 D . NA的提取将单菌落接种至含 5mL的 F L液体培养基的试

2结果与讨论

. AP管中，2 0℃培养 1周。取 3mL菌液，1 0 mi 000r n离 2 1 R D扩增引物的选择 /随机从 4种海绵分离到的 6 4个芽孢杆菌中分别心 5 n弃去上清液。沉淀用 1 L E缓冲液重新 , mi .m T 5种 . 4中的 3种引物进行 R D.C AP P R悬浮，l 0 ri 0

0 0r n离心 5mi,弃去上清液，该步骤选取 1菌株采用 1/ a n 重复 2次。淀加入 7 0 L E缓冲液，4 1%S 扩增，对比 3种引物的扩增效果的多样性发现引物 1沉 61 T a 20 0 DS

溶液、4 0

蛋白酶 K ( ima公司 )溶液，悬浮混可以得到比较丰富的基因多态性，能很好地反映出 4 Sg种菌株之间的细微差异。因此作者在实验中选用引物匀，5 5℃温育 3 i。将温育产物 1 0 mi 0 n a r 30 0r n离心/ 1 n取上清液 05 0mi。 . mL置于 1 E pn of .mL p e d r管中， 51行 R D.C扩增建立基因指纹图。进 AP P R

. A D指纹图的建立与聚类分析 2加入 05 Ti饱和酚，小心上下颠倒混匀，静置 1 2 R P . mL r s 0提取 6 4个芽孢杆菌的总 D NA,采用引物 1进行 mi,使蛋白充分沉淀，1 0 mi,离心 1 i。 n 30 0r n/ 0r n a取上清液，加入等体积的酚.仿抽提液，小心上下氯颠倒混匀，1 0 mi,离心 5mi。取上清液，加 30 0r n/ n入等体积的氯仿抽提液，小心上下颠倒混匀，1 0 30 0 r n/,离心 5 mi。取上清液，加入 01倍体积的 5 mi n . mo L C溶液和 25倍体积的无水乙醇， l Na l/ .颠倒混匀， 1 0/ n 4 00 r,离心 1 i。小心吸取上清液，加入 mi 5r n a 05 7%乙醇冲洗， 30 0/ i . mL 5 1 0 r n离心 1 n弃去 r a 0mi,上清液，重复此步骤一次。将获得的 D NA在室温下 R D-C AP P R扩增，均得到了基因多 …… 此处隐藏：3961字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……