德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效力研究(3)

ＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃＲｐｅｔｉｔｉｖｅＣｏｎｓｅｎｓｕｓ，ＥＲＩＣ）为引物的聚合酶链反应（ＥＲＩＣ—ＰＣＲ）用于研究菌株之间的同源性。ＥＲＩＣ引物可直接扩增未知细菌的基因序列并产生具有菌株特异性的指纹图谱。该技术相对于血清分型用于菌株的描述和比较的区分能力更高。ＥＲＩＣ—ＰＣＲ可用于猪场内和猪场间副猪嗜血杆菌的流行病学研究。根据应用这种技术的研究结果表明，在发病猪场中只有几个９

德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及火活疫茁保护效力研究

（１～３）菌株与发病猪的死亡有关。此外，虽然危害美国猪场的副猪嗜血杆菌主要为血清型４的菌株，但经ＥＲＩＣ－ＰＣＲ检测，每个猪场都有一个不同的流行菌株。采用ＥＲＩＣ—ＰＣＲ对副猪嗜ｍ杆菌进行基因分型，要求使用细菌纯培养，抗生素的运用和该菌不易培养的特性都可能影响从临床病料分离这种细菌。

１．３．４重复序列ＰＣＲ（ｒｅｐ—ＰＣＲ）

重复序列ＰＣＲ（ｒｅｐ—ＰＣＲ）己被用于描述副猪嗜血杆菌分离菌株的多样性以及猪场内和猪场间副猪嗜血杆菌感染的流行病学研究。ｒｅｐ—ＰＣＲ的原理是：设计与散在的重复序列互补的外向寡核普酸引物，进行ＰＣＲ对这些重复序列之间相应的不同长短ＤＮＡ序列进行扩增，产物经电泳后即可形成具有菌株特异性的ＤＮＡ指纹图谱。这些散在的重复序列中，有相当多的重复序列保存在不同种属的细菌，因此同一对引物可应用于多种不同的细菌。由于不同细菌菌株重复序列之间的ＤＮＡ序列长短不同，散在的重复序列探针和基因组指纹图谱可用于区分不同的细菌。自从ｒｅｐ—ＰＣＲ建立以后，重复性回文序列（ＲＥＰ）、ＥＲＩＣ以及ＢＯＸ序列已用于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌指纹图谱发获取ＥＲＩＣ—ＰＣＲ检测出相同血清型的菌株具有不同的基因型。

１．３．５限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）

现已建立一种聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）试验，作为副猪嗜血杆菌流行病学研究分型的另一种方法。以ＰＣＲ—ＲＦＬＰ法对编码转铁结合蛋白的基因ｈｔｐＡ进行分析从而对副猪嗜血杆前进行分型，结果表明１５种副猪嗜血杆菌标准菌株产生１２种不同的图谱。这些标准菌株中，血清型５、１２、１４和１５具有共同的酶切图谱。对１０１株副猪嗜血杆菌现场分离株的分型表现出３３种ＲＦＬＰ图谱，其中有１０株细菌与标准菌株产生的图谱一致。用琼脂扩散试验对６６个菌株进行血清型分型，发现其分属２５种ＲＦＬＰ群，表明在相同的血清型内具有遗传多样性，而２７株不能分型的菌株分属１４种不同的ＲＦＬＰ群。血清型与ＲＦＬＰ之间没有相关性。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分型最为流行（占所研究菌株的２０．８％），其中包括血清型４、５、１３和１５以及不能分型的菌株。ｌＯ

ＪＩＩ东农业大学硕ｌ：专业学位论文

２流行病学

在分离的１５种血清型菌株中，保育猪发病率一般在１０％～１５％，严重时死亡率可达５０％。在应激情况下各年龄猪群都可发病，饲养环境不良、断乳、转群、混群或运输也是常见诱因。该病主要通过空气、猪与猪之间的接触或通过污染排泄物进行传播。病猪和带菌猪是该病主要传染源。在引进种猪时，副猪嗜血杆菌感染是个严重的问题。未免疫的猪场容易受到侵袭，首次感染该菌的猪，症状比较严重。

副猪嗜血杆菌只感染猪，有很强的宿主特异性。副猪嗜血杆菌主要存在于猪的上呼吸道、鼻腔、扁桃体和气管前段内，通过猪群间的接触和空气飞沫以及污染物而发，圭传播。带菌猪和慢性感染猪本病的传染源，副猪嗜血杆菌主要危害２周龄至４月龄的猪只，特别足断奶前后和保育期仔猪多发。通常见于５＂－８周龄，发病率一般在１０％＂５０％，病死率为５０％～９０％。

有些病原体可促进副猪嗜血杆菌的感染，已有证据表明，猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、猪流感病毒、伪狂犬病毒、呼吸道冠状病毒、肺炎支原体、传染性胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、链球菌等都可促进或加重副猪嗜血杆菌的感染，而副猪嗜血杆菌的存在也会加剧原发病的临床表现，使病情复杂化，死亡率增加，经济损失更大。。该病常与ＰＲＲＳ并发，在猪群中存在ＰＲＲＳ感染时，副猪嗜血杆菌的分离率会增加，由副猪嗜血杆菌导致的死亡牢也大幅度增加。

各种应激冈素可诱发和促使本病的发生与流行，如气温突变、空气污染严重、通风不良、寒冷潮湿、不同日龄的猪只混群饲养、密度过大、管理不当、饲料质量差、长途运输等均可导致本病的发生。

引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌有３种，即胸膜肺炎放线杆菌（ＡＰＰ，过去称副溶血嗜血杆菌ＨＰ）、猪嗜血杆菌（Ｈｓ）和副猪嗜血杆菌（ｔｌａｅｍｐｏｈｉＪｕｓｐａＦａｓｕｉｓ，ＨＰｓ）。副猪嗜血杆菌自１９１０年以来就作为病原菌而被认为是猪Ｇｌａｓｅｓｒ病的病原体。然而，直到９０年代才对其发病和防制进行了深入研究。近年来，还从细菌性肺炎、化脓性支气管肺炎病变中分离至－ＩＪＮ猪嗜血杆菌，而且通常将此菌看作是继发性病原菌。在猪繁殖与呼吸综合征、ＩＩ型猪圆环病毒所致疾病（断奶猪多系统衰竭综合征）、伪狂犬病及猪流感等感染之后，这类菌分离的频率，甚至从浆液性一纤维蛋

德州地区副猪嗜血杆菌的分离举定及火活疫苗保护效力研究

白性多发性浆膜炎病例中的分离频率一直都在增高。按Ｋｉｅｌｓｔｅｉｎ—Ｒａｐｐ—Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ（ＫＲＧ）血清分型方法，目前副猪嗜血杆菌至少可分为１５个血清型，其中在德国４、５型最为流行，在澳大利亚５型、１３型最为流行，在美国５型最为流行。在我国，副猪嗜血杆菌在各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，己从北京、黑龙江、辽宁、山东、河南、湖南、宁夏、湖北等省市分离出副猪嗜血杆菌。该菌引起的损失相当严重，如湖南某猪场，１９９９年发生该疾病后，母猪病死率３０％－－一４０％；仔猪病死率９０％以上；架子猪病死率２０％。然而，我国的地方分离株虽多次报道，但由于该菌的分离培养和保存极其困难，尚未有人对其进行过全面的生化鉴定，更未进行系统的血清分型研究。除了ＫＲＧ血清分型方法之外，研究者也尝试用整个细菌体裂解产物进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，对副猪嗜血杆菌进行分型，结果除ＫＲＧ血清型１型为ＳＤＳ—ＰＡＧＥＩＩ型外，其它血清型，如５型、６型、１０型均属ＳＤＳ—ＰＡＧＥＩ型。ＨＰｓ只感染猪，可以影响从２刷龄到４月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，通常见于５～８周龄，发病率可达４０％，严重时死亡率可达５０％。通常可从健康猪的鼻腔分泌液中分离出病菌，还可以从患肺炎猪的肺脏中分离出来。在分离的１５种血清型菌株中，１、５、１０、１２、１３、１４型毒力最强，患猪归于死亡或处于濒死状态；２、４、８、１５型为中等毒力，患猪死亡率低，但出现败血症状，生长迟滞；３，６，７，９和１１型毒力较低，患病猪没有明显的临床症状。此外，Ｍｏｒｏｚｕｍｉ等研究表明，２亿个ｌｉＰｓ可使小鼠致死，并能从肺脏中分离出ｌｉＰｓ；ｌ亿到１６亿个范围的ＨＰｓ可使豚鼠致死，并能从多个脏器甚至大脑中分离出ＨＰｓ，从而确立了小鼠和豚鼠可以作为ｌｉＰｓ研究的模型动物。最近的研究发现，ＨＰｓ感染猪时，伴随着急性和慢性肺炎症状。肺泡液中细胞囚子发生变化，在支气管接种ｌｉＰｓ２４ｈ后，血浆中白介素６的浓度迅速升高，从而影响了血细胞的功能。肺且庄的病变及多处器官的 …… 此处隐藏：2352字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……