德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效力研究(2)

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起猪的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉斯氏病，曾一度被认为是由应激所引起的散发性疾病，后来被证实是由副猪嗜血杆菌所引起。副猪嗜ｍ杆菌可以影响从２周龄到４月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于５．－－，８周龄的猪，发病率一般在１０％～１５％，严重时死亡率可达５０％。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。

早在１９１０年，德国科学家Ｇ１ｓｓｅＦ首次描述了发生浆液性纤维素性胸

德州地区副猪嗜ｍ杆菌的分离裕定及火活疫茁保护效力研究

膜炎、心包炎和脑膜炎猪的浆液性分泌物中的一种革兰氏阴性杆菌，而这种微生物可能是由Ｓｃｈｅｒｍｅｒ和Ｅｈｒｌｉｃｈ在１９２２年首次分离，在随后大量的临床病例分离的基础上，人们对ＨＰｓ的研究逐步深入。ＨＰｓ为革兰氏阴性、具多种不同形态的细菌，从单个球杆状到长的、细长的以至丝状菌体，常可见荚膜。该菌生长依赖炯酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ或Ｖ因子），不需要Ｘ因子（血红素和其它卟啉类物质）。其在巧克力培养基上培养２４～４８ｈ生长较差，为光滑型、灰白色透明、直径大约０．５ｍｍ菌落。如与金黄色葡萄球菌共同培养时，ｔｉＰｓ在葡萄球菌条状菌苔附近呈卫星生长，生长良好，菌落直径可达１～２ｍｍ。ＨＰｓ在血液琼脂上呈小而透明的不溶血菌落，在加ＮＡＤ、马血清和酵母浸｛Ｉ｛物的ＰＰＬＯ培养基上生长良好。生化反应：尿酶试验阴性、氧化酶阴性、接触酶试验阳性，可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、Ｄ一核糖和麦芽糖等。

随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典犁细菌性疾病。西方发达国家在大量分离副猪嗜ｍ杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Ｋｉｅｌｅｔｉｎ—Ｒａｐｐ—Ｇａｂｒｉｄｅｓｏｎ（ＫＲＧ）琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜ｍ杆菌分为１５个血清型，另有２０％以上的分离株血清型不可定；根据德国、美国、加拿大、日本和两班牙等国家的血清流行病学调查，以血清型４、５和１３最为流行。

１．１ＨＰｓ分离鉴定与培养

副猪嗜血杆菌的生长依赖ＮＡＤ，对细菌的分离培养可按常规操作将病料接种于鲜血琼脂平板（在金黄色葡萄球菌划线附近生长），补充ＮＡＤ的ＰＰＬＯ液体培养基或巧克力琼脂平板。细菌的分离培养对确诊是必要的，但往往不能成功，这是冈为副猪嗜血杆菌十分娇嫩，相对于标本中可能同时出现的其它细菌，难以满足其生长需要。加拿大安大略省的诊断实验室用回归分析法（Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ）分析表明副猪嗜血杆菌的真实发病率可能为报道的ｌＯ倍之多，部分原因是由于难以确认采集来的标本中是否存在副猪嗜血杆菌。副猪嗜血杆菌不易培养的特性经常影响这种细菌从临床样品的分离。对副猪嗜ＪｆＩＬ杆菌分离鉴定的研究表明使用平板稀释技术和在培养基中加入抗生素（例如林肯霉素和杆菌肤）可以提高从被污染病料中的细菌分离率。细菌分离鉴定时应当采集处于疾病６

东农业大学硕Ｉ：专业学位论文

急性期的猪并且没有应用抗菌素的病料，最好选择浆膜表面物质或渗出的脑脊髓液及心脏血液，这样既可以减少杂菌的污染又可以增加分离到致病菌的机率。在送到诊断实验室之前接种到转移培养基上，也能由这种液体中获得副猪嗜血杆菌。有时其它的ＮＡＤ依赖的细菌（Ｌ类嗜血杆菌、猪放线菌、吲哚放线菌等）会被误认为副猪嗜血杆菌，这些细菌在鼻窦、扁桃体或肺脏中大量存在，但只有较低的毒力，因此在进行生化鉴定时需要特别注意与以上其它不溶血的Ｖ一因子依赖性细菌区分开来。

１．２ｔｉＰｓ菌体结构

副猪嗜血杆菌的芮体具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、丝状的菌体。副猪嗜血杆菌通常具有荚膜，但在体外培养时易受影响。Ｍｏｒｏｚｕｍｉ和Ｎｉｃｏｌｅｔ对分离自外观健康猪的鼻腔和分离自病理状态下的猪的不同副猪嗜血杆菌菌株进行比较，包括是否具有荚膜，在吖啶黄中或在煮沸后的细菌粘附能力，以及在聚丙烯酞胺凝胶电泳（ＡＰＧＥ）后的多肤图谱。通过十六烷溴化三甲铵（Ｃｅｔａｖｌｏｎ，塞太弗伦）处理，发光情况检测和荚膜染色等方式对荚膜进行检查，结果３２株分离自不同组织的副猪嗜血杆菌中有２０株具有荚膜。研究发现有荚膜的菌株更加趋向于球杆菌形态，相比之下那些不能检测出荚膜的菌株具有多种形态，具有从短杆菌到纤细的丝状菌的变化，其中后一种菌株吖啶黄染色或煮沸后粘附在一起。根据该抽提物电泳时向正极移动，并且经高压蒸汽灭菌，蛋白酶或胰酶处理后仍然稳定等特点，研究人员推测这些荚膜物质为酸性多糖。十六烷澳化三甲铵沉淀实验表明培养时间延长（４８ｈ）以后荚膜物质丢失。另外，所研究的这些菌株中有四分之一菌株的荚膜物质不能通过十六烷溴化三甲铵沉淀，由此表明它们的化学结构不同，还存在其它的多糖结构。可以和溴化三甲铵发生反应的有荚膜菌株的可溶性抗原有热稳定性并且可以抵抗蛋白水解酶，因此表明酸性多精的存在。吖啶黄染色阳性的菌株属于一种特定的ＡＰＧＥ图谱（ＩＩ型），这些菌株似乎比那些主要从表面健康猪群的鼻腔分离的有荚膜菌株更加与病理状态相关联。由此提出假设，在吖啶黄中的凝集能力连同ＡＰＧＥ图谱型ｒｌ型可能与毒力的特殊结构有关。除了与荚膜因素有关以外，副猪嗜血杆菌在鸡胚绒毛膜和尿囊膜培养时同样具有细丝状纤毛样的结构。

德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及火活疫苗保护效力研究

巴斯德氏菌科中数种细菌的夹膜、纤毛和外膜蛋白（Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＯＭＰ）与其在上呼吸道的定居有关，其中包括嗜血杆菌属的细菌。关于荚膜、菌体蛋白与副猪嗜血杆菌毒力之间的相关性仍争议。对副猪嗜血杆菌的菌体蛋白和外膜蛋白进行聚丙烯酞胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＡＩ，ＧＥ）的结果显示不同菌株之间的蛋白质图谱具有差异，在毒力和某种特定蛋白质之间可能存在着联系，潜在的致病性副猪嗜血杆菌分离菌株具有一群分子量主要在约３７ｋＤａ大小的蛋白质组，并将这些细菌分类为聚丙烯酰胺电泳（ＡＰＧＥ）ＩＩ型，而将缺乏这种特殊蛋白质组的副猪嗜血杆菌分离菌株分类为ＡＰＧＥＩ型。有一项研究中，分离自病料的菌株中有９０％以上属于ＡＰＧＥＩＩ型，而分离自鼻腔的菌株平均分布于ＡＰＧＥＩ型和ＡＰＧＥＩＩ型或者是四分之三为ＡＰＧＥＩ型而四分之一为ＡＰＧＥＩＩ型。这些结论在后来通过运用计算机对副猪嗜血杆芮茼体蛋白图谱的分析得到证实。Ｍｏｒｏｚｕｍｉ和Ｎｉｃｏｌｅｔ报道了分离白健康猪上呼吸道的大多数副猪嗜血杆菌具有荚膜，而从其它部位分离的菌株以无荚膜的占多数。但是，通过活体内传代的方法可筛选出荚膜化的副猪血杆菌克隆，而在培养基上经多次传代后有荚膜细菌的数量减少。聚丙烯酞胺凝胶电泳和单克隆抗体的免疫印渍试验还显示副猪嗜血杆菌的多糖具有多样性，有毒力菌株和无毒力菌株的脂多糖图谱相似，因此细菌脂多糖与其毒力之间是否有关系也还没有弄清楚。副猪嗜ｍ杆菌表面的细丝状结构是菌毛，细菌经活体内传代后形成纤毛样的结构，但其在粘附和致病方面的作用仍有待确认。由于从表面健康的鼻腔中普遍能分离出 …… 此处隐藏：2541字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……