单糖与糖胺的水相乙酰化及其气相色谱测定

2003年9月September2003

色谱

ChineseJournalofChromatography

Vol.21No.5

527

单糖与糖胺的水相乙酰化及其气相色谱测定

黄雪松

(山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安271018)

关键词:毛细管气相色谱;单糖;糖胺;乙酰化

中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2003)05 0527 01

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

岛津GC 17气相色谱仪,配有氢焰检测器、HP色谱工作站。所用9种单糖和2种糖胺标准品、甲基咪唑、醋酸酐、正辛醇均为Sigma公司产品,硼氢化钠为Aldrich公司产品。1.2 单糖与糖胺的还原 分别配制木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、阿洛糖(All)、葡萄糖(Glu)、藻岩糖(Fuc)、葡萄糖胺(GluNH)、半乳糖胺(GalNH)标准溶液(100mg/L)各100mL,同时配制混合标准糖样(1g/L),加入阿洛糖为内标。将配制的标准糖液置于-20 冰箱中保存备用,或加入5%的苯甲酸后置于-4 冰箱中存放备用。

取标准单糖及糖胺溶液各5mL,分别加入1mL阿洛糖为内标及5 L正辛醇作消泡剂,加入新配制的2%硼氢化钠(用氨水配制)0 2mL,于40 下保温30min,使糖(或糖胺)完全还原为糖醇(或糖胺醇),最后加入0 4mL冰醋酸以中止过量的硼氢化钠继续作用。混合标准糖样同法操作还原。1.3 糖醇与糖胺醇的乙酰化 取上述各种单糖、糖胺及混合标样的还原液各0 2mL,加入0 3mL甲基咪唑和2mL醋酸酐,在室温下乙酰化反应10min。加入5mL蒸馏水以降解过量的醋酸酐。用流动自来水冷却至室温后,加入1mL二氯甲烷,使之充分混合,静置10min,吸去上层水相后,再加入3mL蒸馏水,同上法操作,弃水层,重复操作3次。在所获下层二氯甲烷相中加入适量的无水硫酸钠脱水干燥后,可直接用于测定乙酰化的单糖和糖胺。

1.4 气相色谱(GC)分析条件

DB 225毛细管柱(15m 0 25mmi d ,0 25 m);柱温:初温180 ,以4 /min升至220 ,并在220 保温30min。进样量2 L。载气为氩气,流速为2mL/min。氢焰检测器,检测器温度为270 。

图1 混合标样乙酰化的气相色谱图

质,这也有利于气相色谱测定时减少杂质峰的产生。

本方法的另一优点是用阿洛糖作内标。内标与待测单糖经相同的还原、乙酰化等处理,保证了实验条件的一致性,减少了取样、进样、衍生化等产生的实验误差,保证了结果的正确性。我们也曾用环己六醇作内标,结果与阿洛糖一致。2.2 方法的准确性、重复性及应用实例

利用3次GC测定值与实际值间的平均相对偏差表示本测定方法的准确度,结果是:葡萄糖3 56%、木糖3 80%、藻岩糖1 33%、阿拉伯糖-1 08%、核糖3 00%、鼠李糖3 80%、甘露糖2 57%、半乳糖3 98%、阿洛糖4 25%、葡萄糖胺4 96%、半乳糖胺5 42%。由这些结果可以看出,阿拉伯糖可产生负误差,其余单糖和糖胺均产生正误差;两种糖胺的测定误差较大,这可能是由于其保留时间长、峰形较宽、选取峰面积时误差较大所致。

利用GC测定的相对标准偏差表示本测定方法的重复性(n=3),结果是:葡萄糖3 92%、木糖3 29%、藻岩糖1 26%、阿拉伯糖2 11%、核糖3 55%、鼠李糖1 62%、甘露糖4 02%、半乳糖1 75%、阿洛糖2 64%、葡萄糖胺6 54%、半乳糖胺7 79%。其变化情况同准确度的变化。

我们采用本法成功地测定了金耳(Tremellaaurantial ba)、桃胶和一种海藻(Sargassumpatens)等10多种植物多糖水解产物中单糖种类及其组成比例,结果均比较理想。如在金耳多糖!中,葡萄糖、甘露糖和木糖的质量分数依次为2 5%,35 9%和16 9%,并含有微量的阿拉伯糖、鼠李糖和藻岩糖。在海藻多糖 中,藻岩糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和半乳糖胺的质量分数依次为35 29%,13 5%,12 91%,18 37%,4 82%和7 58%。

另外,我们采用HP 5(30m 0 25mmi d ,0 25 m)毛细管柱也获得了类似的结果,只是比DB 225柱用的时间稍长,五碳糖的分离效果较差。

2 结果与讨论

2.1 标准糖样的色谱行为

受篇幅所限,9种单糖和2种糖胺的定性色谱图略。混合标准糖样的色谱图见图1。从图1可看出:所测9种单糖和2种糖胺都对应有单一的色谱峰,说明无副反应发生,完全能满足单糖衍生化反应及气相色谱测定的要求。

本方法之所以能在水相中对单糖进行完全的乙酰化反应,是因为使用了甲基咪唑作为乙酰化反应的催化剂,否则在水相中是难以进行单糖乙酰化反应的。另外,乙酰化反应完成后的反复水洗操作,除去了乙酰化反应中的水溶性杂

收稿日期:2002 11 02

作者简介:黄雪松,男,1957年生,教授,博士,目前工作单位为暨南大学理工学院食品科学与工程系.

基金项目:留学回国人员科研启动基金资助项目.