西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT—PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%～95.0%和96.5%～98.6%.将CP基因定向插入EcoR Ⅰ／Sal Ⅰ切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2～8h后,成功表达了分子量约为37kD的CP蛋白

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第3 6卷第 4期20 0 8年 7月

河南师范大学学报 (自然科学版 )J u n l f Hea r lUn v riy ( t r l ce c ) o r a n n No ma ie st Na u a in e o S

Vl . 6 No 4 0 3 .

Juy 2 0 l. 0 8

文章编号：0 0 2 6 ( 0 8 0—0 1—0 10— 3720)4 17 3

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达张建新刘起丽吴云锋，,(.南师范大学生命科学学院，南新乡 4 30;.北农林科技大学植保学院与陕西省农业分子 1河河 5072西生物学重点实验室，西杨凌 7 20 )陕 11 0

摘要：利用 R—C TP R方法获得了西瓜花叶病毒( WMV陕西分离物外壳蛋白( P基因，小为 8 3 p将 ) C )大 4 . bC基因克隆到 p P MD1一 i l Vetr测序分析发现与各个国家 C核苷酸和氨基酸同源性分别为 9. ~ 8T Smpe co, P 30 9.和 9 .%~ 9 . . C基因定向插人 E o/ a切开的 p T 0 50 65 86将 P c R IS lI E 3 a中，建了原核表达载体 p T3一构 E 0 WC, P转化大肠杆菌 B 2 . I T诱导 2 L 1经 P G~8h后，功表达了分子量约为 3 D的 C成 7k P蛋白.过不同时间诱导发通现，人 I T 加 P G 4h后蛋白开始表达， 8h后表达量比较大 .以诱导的蛋白为抗原免疫家兔，备了 W MV C制 P抗血清， E IA法测其效价为 1 64 0 Wetr lt析能与 C LS/ 0, senbo分 P发生血清学反应 .

关键词：西瓜花叶病毒 .壳蛋白；夕 原核表达；抗血清中图分类号： 994;424 Q 3. 6￥ 3.文献标识码： A

西瓜花叶病毒 ( tr lnmoa cvr s WMV)马铃薯 Y病毒属重要成员， Waemeo s i iu, 是此病毒被多种蚜虫以非持久方式传播 . 9 4年，国的 An esn等人l首次在 F o i 15美 d ro 1 lr a的西瓜上发现该病毒， 9 5年 We b和 d 16 b

S oL在西瓜上最早分离得到该病毒. c t 2自然条件下 wMV可侵染葫芦

科、科、科等 2藜豆 7科 1 O多种植物， 7常与黄瓜花叶病毒 ( MV)小西葫芦黄化花叶病毒 ( YMV)南瓜花叶病毒 ( q C、 Z、 S MV)等病毒复合侵染，、近几年西瓜病毒病的发生呈上升趋势，国大部分地区因西瓜病毒病造成的损失为 3~ 5,至绝产， 我 O O甚由 wMV引起的病毒病已经成为制约西瓜高产稳产最主要的因素之一 _ . 3目前，] wMV在田间及转基因抗病育种中主要靠 C P蛋白的抗血清与分子检测， WMV是线状病毒，但自然繁殖和提纯比较困难，限制了该病毒的在研究中的检测 .本文首次克隆了 WMV陕西分离物的 C基因，对其进行了体外表达，备了抗血 P并制清，为该病毒的抗血清与分子检测及研究其遗传变异等奠定了基础.

1材料与方法1 1材料 .

1 11毒原 ..

wMV采自陕西杨凌地区的西瓜田，分离鉴定后接种于西葫芦上，病后收集症状典型的经发 Es e i i.oi M1 9 B 2, c rc a cl J 0, L 1表达载体 p T 0 h h E 3 a为本实验室保存.隆载体 p克 MD1 8

叶片，冻存于一8 C冰箱中备用 . 0。 1 1 2菌株与质粒 ..一

T s l v co购于 T k r i e etr mp a aa公司，

1 2 3酶与试剂限制性内切酶 E o ,a, ML反转录酶， qD . . cR IS l M— V I Ta NA聚合酶， 4DNA连接酶购自 T F r na公司 . io u laeI hbtrI TG购自上海 TOYO eme ts R b n c s n ii、P e o TA公司.凝胶回收试剂盒、粒微量抽提试质

剂盒购于优晶生物工程有限公司.蛋白胨、母提取物、 i饱和酚，胰酵 Tr一 s氯仿，自北京鼎国公司.脂糖购购琼买 Sai p ns h进口分装.1 2方法 .

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收稿 E期： 0 7 1~0 l 20— 0 9基金项目：育部长江学者和创新团队发展计划资助 ( 0 5 8 教 205)

作者简介：张建新 (9 4 )男， 1 7一，山东陵县人，南师范大学讲师，士，要从事植物病毒学研究河博主

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通讯作者：吴云锋，北农林科技大学教授，西博士生导师，要从事植物病毒

学研究 .主

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