化学发光酶免疫法检测玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

楚金申，许杨，何庆华，卢江

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室中德联合研究院，江西南昌330047）

摘

要：应用抗脱氧镰刀菌烯醇单克隆抗体，以辣根过氧化物酶催化鲁米诺－过氧化氢化学发光体系，建立了一种简

便、快速、高特异性的间接竞争化学发光酶免疫法用于检测谷物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。所建立的方法分析灵敏度为10.7ng/mL，批内变异系数小于8.1%，批间变异系数小于12.8%，玉米的加标回收率为91.2%～99.5%，与其他常见真

所建立的标准曲线相关系数为0.9902，检测线性范围为12.9～163.7ng/mL，检测时间为40min。菌毒素未见明显交叉，

关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），间接竞争化学发光酶免疫法（CLEIA），检测

*

Chemiluminescenceenzymeimmunoassayforthedeterminationofdeoxynivalenolincorn

CHUJin－shen，XUYang*，HEQing－hua，LUJiang（Sino－GermanyJointResearchInstitute，TheStateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology，NanchangUniversity，Nanchang330047，China）

Abstract：Asensitiveindirectcompetitivechemiluminescence’senzymeimmunoassay（CLEIA）fordeoxynivalenolincornwasdeveloped.TheoptimizedCLEIAgavealimitdetectionof10.7ng/mLandadetectionrangeof12.9～163.7ng/mL，withanIC50of46.01ng/mLanditwasabout4.01timesmoresensitivethanthatofcolorimetricELISA.Ithadbeenvalidatedoncerealssamplesintermsofprecision（intra－andinterassaycoefficientvariationsoflessrespectively）andaccuracy（meanrecovery91.2%～99.5%）.Theseassayperformancesthan8.1%and12.8%，

indicatedthatCLEIAwascapableofbeingappliedforthespecificdetectionandroutinemonitoringofDONincornsamples.

Keywords：deoxynivanol；CLEIA；detection中图分类号：TS207.3

文献标识码：A

文章编号：1002－0306（2011）09－0407－04

［9］

线性范围宽、测试中无需使用对人体有害的试剂。本研究采用鲁米诺－过氧化氢化学发光体系建立了

DON），脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivanol，是

一种单端孢霉烯族真菌毒素，分子结构式如图1所示，主要由禾谷镰刀菌产生，污染玉米、小麦和大麦

［1］

具有免疫毒性、胚胎毒性和细胞毒等谷物及其制品，

［2－3］

，性等所有的动物都会对DON有不同程度的过敏

［4］

反应，其中猪的反应最为强烈。我国规定谷物及其［5］

制品中DON的限量标准为1mg/kg（1000ng/kg）。目前常用的检测DON的方法主要有高效液相色谱［7］

（HPLC）法［6］、气相色谱法（GC/MS）和酶联免疫吸［8］

附法（ELISA）等。前两种方法灵敏、准确，但耗时，费力，成本高且需要昂贵的设备和专业的人员操作；

检测玉米种DON的间接竞争化学发光酶免疫法

（CLEIA）。该方法灵敏度高、特异性好、简单快速

。

酶联免疫吸附法快速、特异性好，但灵敏度不够高。间接竞争化学发光酶免疫法既具有放射免疫法的高

又具有酶联免疫法操作简便、快速的特点，灵敏度，

图1脱氧雪腐镰刀菌烯醇的结构式

1

1.1

材料与方法

材料与仪器

DON人脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体腹水、

实验室自制；脱氧雪腐镰

收稿日期：2010－09－14*通讯联系人

工抗原（DON－HG－BSA）

作者简介：楚金申（1985－），男，硕士研究生，研究方向：工业微生物。：“国家高技术研究发展计划”基金项目项目资助（2007AA10Z427）。

刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、伏马菌素B1（FumonisinsB1，FB1）、伏马菌素B2（FumonisinsB2，

407

FB2）、OTA）、赭曲霉毒素A（ochratoxinA，黄曲霉毒素B1（AflatoxinsB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、羊抗鼠IgG－HRPSigma；辣根过氧化物酶（HRP）（RZ＞3）昌博恒。

化学发光检测仪学发光板条

Thermo公司（USA）。

Thermo公司（USA）；96孔化

购自深圳金灿华有限公司；酶标仪

上海生工；化学发光底物液

Pierce公司（USA）；检测DON的ELISA试剂盒南

的批内及批间变异。

d.回收率：在玉米样品中分别添加50、100、150μg/kg的DON标准品，依照1.2.5进行样品提取，分别用ELISA试剂盒和CLEIA检测样品浓度。

e.特异性：选取五种常见的真菌毒素：黄曲霉毒素B1（AFB1）、伏马菌素B1、伏马菌素B2、玉米赤霉烯酮（ZEN）和赭曲霉毒素A（OTA），采用CLEIA方法测定了与DON的交叉反应。

1.2.5样品提取称取5g粉碎样品置于100mL具

准确加入25mL超纯水。将加入水的样塞三角瓶内，

品放入振荡器内，充分振荡3min后，用定性滤纸过

滤，取滤液4mL，加入4mL超纯水，混匀，用定性滤纸过滤，滤液为样品待检液。

1.2

1.2.1

实验方法

间接竞争酶联免疫分析法（ELISA）用

0.05mol/mL磷酸缓冲液稀释抗原至1.5μg/mL，向微4℃包被12h，PBST洗涤液洗3孔板中每孔加100μL，

37℃封次，每孔加300μL封闭液（5%的脱脂牛奶），闭1h后，甩去封闭液洗涤3次，在吸水纸上拍干，每10、20、孔中分别加入系列稀释的DON标准品（0、50、100、200、400ng/mL）或样品50μL，同时加入

1∶60000倍稀释的抗体溶液50μL，37℃温育混匀，30min，洗涤4次，加入1∶2000稀释的羊抗鼠IgG－HRP，100μL/孔，37℃温育30min，洗涤4次，拍干，加100μLTMB显色液，显色反应5min后加2mol/L硫

并于450nm处检测吸光度酸50μL终止反应，（OD450nm）。1.2.2

间接竞争化学发光免疫法（CLEIA）用

0.05mol/mL磷酸缓冲液稀释抗原至1.0μg/mL，向微4℃包被12h，孔板中每孔加100μL，然后用PBST洗涤液洗3次，每孔加300μL封闭液（5%的脱脂牛37℃封闭1h后，奶），甩弃封闭液洗涤3次，在吸水纸上拍干，每孔中加入系列稀释的DON标准品（0、5、10、20、50、100、200ng/mL）或样品50μL，同时加入1∶10000倍稀释的抗体溶液50μL，37℃温育混匀，10min，洗涤4次，加入1∶1000稀释的羊抗鼠IgG－HRP，100μL/孔，37℃温育30min，洗涤4次，拍干，每

用化学发光检测仪测量相对孔加发光底物液100μL，

RLU）。发光强度单位（relativelightunits，

［10］

1.2.3检测条件的确定采用方阵滴定确定ELISA抗原和抗体反应的工作浓度。据文献表明

，RLUmax/IC50越大，CLEIA的灵敏度和重复性越好，因此引入RLUmax/IC50评价各种因素的影响。按

［11］

2

2.1

结果与分析

化学发光免疫分析法的建立

2.1.1

抗原包被浓度的选择采用柠檬酸缓冲液分

0.5、1.0、2.0μg/mL，别稀释抗原至0.25、其他步骤参IC50随着抗照1.2.2。结果如图2所示，由图2可见，

RLUmax/IC50随着原包被浓度的增大先减小然后增大，

抗原浓度的增大先增大然后减小，在抗原浓度为

1.0μg/mL时达到最大，因此选用1.0μg/mL作为抗原包被浓度

。

图2

2.1.2

CLEIA抗原包被浓度的优化

抗体工作浓度的选择用磷酸缓冲液将抗体

10000、20000、40000倍，分别稀释5000、其他步骤参照1.2.2。结果如图3所示。由图3可见，随着抗体IC50逐渐减小然后增大，RLUmax/IC50稀释倍数的增大，

逐 …… 此处隐藏：7270字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……