臭氧与药物治疗对兔骨性关节炎血清中IL_1_TNF_含量的影响

（总第166期）2012年第3期

臭氧与药物治疗对兔骨性关节炎血清中IL-1β、TNF-α含量的影响

符路娣

（广州中医药大学实验动物中心，广东广州510405）

摘要：目的

通过观察比较臭氧与药物治疗兔骨性关节炎血清中IL-1β、TNF-α水平的变化，探讨比较臭氧及药物治

疗骨性关节炎的作用效果。方法新西兰兔80只，采用II型胶原蛋白酶关节腔内注射法诱导骨性关节炎模型。随机分为正常组、模型对照组、10ug/ml臭氧关节腔内注射组；20ug/ml臭氧关节腔内注射组；40ug/ml臭氧关节腔内注射组；低剂量药物灌胃组；中剂量药物灌胃组；高剂量药物灌胃组；每组10只。造模4周后进行臭氧干预，同时进行药物灌胃治疗，每周2次，共4周。末次注射及药物灌胃后4周抽取血液样本检测血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素（IL）-1β含量。结果各治疗组及模型组的血清中TNF-α和IL-1β含量均高于正常组（p<0.05）；臭氧治疗组与模型组间的血清TNF-α和IL-1β含量无显著性差异（p＞0.05）；药物灌胃治疗组与模型组间的血清TNF-α和IL-1β含量显著性差异（p<0.05）。结论（1）骨性关节炎动物模型出现血清TNF-α和IL-1β含量升高，说明造模成功；（2）臭氧无抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用；（3）药物灌胃治疗均能抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用。

关键词:骨关节炎；臭氧治疗；药物治疗；IL-1β；TNF-α；水平影响

中图分类号：S853.4文献标识码：B文章编号：1003-8655（2012）03-0006-03

骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是我国四大老0.5ml制备骨性关节炎动物模型，造模成功后随

机分为模型对照组(简称B组)和治疗组，治疗组又分为:10ug/ml臭氧关节腔内注射治疗组（简称

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年病之一，是一种严重影响病人生活质量和社会生产力的慢性进行性骨关节病。该病不仅发生关节软骨损伤，还累及整个关节，包括关节软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉，最终发生关节软骨退变，纤维化，断裂溃疡及整个关节面的损害[1]。近年来，随着对OA发病机制研究的深入，认识到在OA的病理过程中白细胞介素-

试

验研究

C10组）,20ug/ml臭氧关节腔内注射治疗组（简称C20组）；40ug/ml臭氧关节腔内注射治疗组（简称C40组）；低剂量活血止痛胶囊灌胃治疗组（简称D低

组）,中剂量活血止痛胶囊灌胃治疗组（简称D组）；高剂量活血止痛胶囊灌胃治疗组（简称D组），每组10只。

中高

1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)是促进软骨基质降解和

关节软骨破坏的致炎因子。目前对OA的治疗方法颇多但效果不够理想。本实验应用家兔OA模型进行研究，观察比较臭氧和药物治疗的效果。现将实验报告如下。

1.2方法

（1）II型胶原蛋白酶的配制：将II型胶原蛋

1.2.1造模方法

白酶按2mg/0.5ml的浓度溶解于生理盐水中，用

1材料与方法

0.2um的无菌试管滤器过滤后装入50ml无菌瓶中，并置于0℃以下冰箱内保存备用。

（2）蛋白酶溶液的注射：将新西兰兔固定于固定架上，剪去膝关节处的兔毛，75%酒精消毒后用左手从下方和两旁将关节固定，在髌韧带附着点外上方约0.5cm处进针。针头从上前方向下后方倾斜刺入，直至针头遇阻力变小为止，然后针头稍后退，以垂直方向推入，当出现落空感时，表明已进入关节腔内，即可注入药液。

1.1OA模型制备及分组

新西兰兔80只，体重2.2-2.5kg，雌雄各半，

由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0020。随机抽取10只作为正常对照组（简称A组），正常组不做任何处理，正常喂养。其余70只，分别于实验的第1天、第4天于右膝关节腔内注射Ⅱ型胶原蛋白酶溶液

收稿日期：２０１２－０４－０８

基金项目：广东省卫生厅２００９年度研究计划项目［项目编号：Ａ２００９２３２］；

广东省中医药局２０１０年度科研课题［项目编号：２０１０３９５］。

作者简介：符路娣（１９７１－），女，副研究员，硕士，从事实验动物学工作。

1.2.2细胞因子检测

A.经耳中动脉抽取5ml血液，4000转离心10min，分离血清约600μl，保存于-80℃冰箱备检。

B.双抗体ELISA法测定IL-1β、TNF-α的含

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量。根据血清样品的吸光度值,通过拟合后的公式计算出其浓度。

性粒细胞合成，分为膜结合型（IL-1α）和可溶型（IL-1β）两种。IL-1多存在于血液和组织中，它在

1.3实验设备与药物

A.实验设备：意大利ECO3diFrancoSardi公

司生产的Ozonline-E80型医用臭氧发生器；

OA中主要参与刺激前列腺炎等介质释放，上调

内皮细胞粘附分子受体表达，以及促进胶原酶和其他中性蛋白酶合成，从而增强滑膜和滑液内炎症反应，促进滑膜细胞增生正常状态下保持平衡；失衡时，产生免疫病理反应[3-6]。有研究证明IL-1是炎症调节的始动因素，与受体（IL-1RI）结合后形成复合物，继而发生一系列的级联反应，导致

B．药物：活血止痛胶囊（中药制剂，主要组成：

当归、三七、土鳖虫等）。

1.4统计学处理

数据以SPSS软件进行统计分析，并以均数

上标准差表示结果。

NO、PGE2、IL-6、IL-8以及基质金属蛋白酶(MMPs)水平增高，从而介导软骨细胞凋亡，合成II

型胶原和蛋白多糖的能力损害，以及软骨基质降解[7-8]。

2结果

各实验组血清TNF-α和IL-1β活性的测量

结果详见下表。

由表可见，B、C、D组与A组比较有显著性差异（p<0.05）,这说明造模成功；C组与B组比较没有显著性差异（p＞0.05）,这说明臭氧无抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用；D组

表各组血清TNF-α和IL-1β浓度

3.2TNF-α在OA病程中的作用

TNF-α是体内炎症细胞分泌的一种细胞因

子，是复合体，具有多种生物学活性。在骨性关节炎滑液中TNF-α是最早出现的细胞因子，而且影响关节软骨的降解过程[9]。TNF-α可通过直接与破骨细胞前体上的TNFR-1结合，进而诱导破骨细胞的成熟，或者使间充质细胞上的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）表达增加，进一步诱导破骨细胞发育成熟或破骨细胞功能增强，导致骨质吸收和骨质破坏[10]。

本实验中检测到OA模型中的血清IL-1β和

组别Ａ（ｎ＝１０）Ｂ（ｎ＝１０）Ｃ１０（ｎ＝１０）Ｃ２０（ｎ＝１０）Ｃ４０（ｎ＝１０）Ｄ低（ｎ＝１０）Ｄ中（ｎ＝１０）Ｄ高（ｎ＝１０）

ＴＮＦ－α（ｐｇ／ｍｌ）９．８０±０．０８４５．２７±０．４２４９．６２±０．４７５０．３２±０．１１４７．３２±０．８９２０．６７±０．４１１９．５６±０．６９１７．６８±０．９１

ＩＬ－１β（ｐｇ／ｍｌ）８．８７±０．６６１５．９５±０．７１１４．５３±０．２３１３．７７±０．３４１４．１５±０．４５１０．４８±０．４９９．７６±０．５３９．３８±０．３６

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TNF-α含量都升高,与其他研究结果一致,采用臭

氧进行局部治疗的血清IL-1β和TNF-α含量的变化无统计学意义,这也说明臭氧的局部应用并没有对这两种细胞因子的产生起到抑制或降低其含量的作用。臭氧对骨关节炎的作用机制,仍需进行更多的实验研究进一步证实。

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