实验四 PCR扩增技术

pcr扩增

实验四

PCR扩增技术

pcr扩增

一.实验目的及背景

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是80年 代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝，P CR技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领 域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检 测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA, 引物和4种脱氧核苷酸存在的条件 下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，PCR技术的特异性取决于引物 和模板DNA结合的特异性。 反应分三步：①变性(denaturation);② 退火(annealing);③延伸(ex tension),反应过程见图。

pcr扩增

模板DNA在94℃条件下变性形成单链； 在5 5℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分 别与其同源序列结合；70℃下在耐热性DNA 聚合酶Taq 酶催化下， 在4种dNTP存在条件下 延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成 的DNA为模板进行同样反应，如次往复循环30 次，由于每次循环目标DNA都以2n次幂扩增， 30次循环后目的DNA的量增加10 6-7倍。成 功的PCR反应要求反应有很好的特异性和相当 的扩增效率。 要达此目的PCR反应要注意以下 问题：

pcr扩增

1.

DNA模板：反应中DNA量在50ng~200ng左右。 且DNA纯度较高， 以增加反应特异性。 dNTP:反应体系中达100μM~200μM。 Mg2+:Mg2+是Taq酶的辅基,浓度在2.0mM左右，浓度太 低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。

2. 3.

4.

引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基 左右；G+C含量在40 %-70%之间；引物内部不能有 回文序列；引物3’端不能互补。

pcr扩增

5.

Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性DNA聚合酶，

在95℃时30分钟还有50%活力。6. 7.

变性温度：在93~95℃之间使模板充分变性。 复性温度：55℃左右，此温度选择是根据模板和引物 配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。

8.

延伸温度：70~72℃左右，为Taq酶最适反应温度。

pcr扩增

二.实验试剂及仪器

10×buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 1% 明胶 TritonX-100

MgCl2 4×dNTP: 模板： Taq酶：

2.5mM 1mM

引物：actin上， actin下 20ng/μl 5u/μl

PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统

pcr扩增

PCR仪

凝胶成像系统

pcr扩增

三. 实验方法1.向无菌的200μl Eppendorf管中依次加入以下溶液 反应物 10×buffer 4×dNTP(1mM) 无菌水 Taq酶 (1

U/ul) 引物 上 引物 下 模板DNA (20ng) 总体积 体积 2.5μl *5 2.5μl *5 18μl *5 0.5μl *5 0.5μl *5 0.5μl *5 0.5μl 25μl 12.5 12.5 90 2.5 2.5 2.5 混合，吸取24.5μl

pcr扩增

2. 3.

反应体系混匀，离心 在PCR仪上按以下方式循环

94℃变性 5分钟94℃变性 45秒 30个循环 55℃退火 45秒

72℃延伸 1分钟72℃延伸反应10分钟。4.

取5μl反应液加4μl Loading buffer在1.5%琼脂糖凝胶上120伏，电 泳2小时。 在凝胶成像系统上观察记录实验结

5.

pcr扩增

四. 结果分析记录实验结果，并估测PCR扩增产物分子量。

问题与讨论： 1.简述PCR基本原理 2.进行一次成功的PCR反应应注意哪些问 题？。