稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用

稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用

第18卷第4期2005年11月

同 位 素

JournalofIsotopes

Vol.18 No.4Nov.2005

稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用

孟丽丽,齐孟文

(中国农业大学核技术应用实验室,北京 100094)

摘要:蛋白质表达水平定量分析是蛋白质组学研究的一项关键内容,它依赖于精确的、高通量的、具重复性的技术。目前,应用稳定同位素标记技术定量蛋白质表达水平是最准确的方法之一,且联合色谱质谱技术更具优势。本文论述了这一技术的广泛应用和最新的研究进展。关键词:蛋白质组;稳定同位素标记;质谱;定量分析

中图分类号:TL92;TQ937 文献标识码:A 文章编号:100027512(2005)0420245205

ApplicationofQuantitativeProteomicsExpression

AnalysisUsingStableIsotopeLabeling

MENGLi2li,QIMeng2wen

(LaboratoryforApplicationofNuclearTechniques,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100094,China)

Abstract:Quantitativeproteinexpressionprofilingisacrucialpartofproteomicsandre2quirestechniquethatareabletoefficientlyprovideaccurate,high2throughputandreproduc2ibledifferentialexpressionvaluesforproteinsintwoormorebiologicalsamples.Atpresent,stableisotopelabelingisprobablyconsideredasoneofthemostaccuratewaystorelativelyquantifyproteinexpressionlevelsandadditionallystableisotopelabelingmaybedirectlycombinedtoLCMS/MSapproaches.Insummary,thistechniquehasitsadvantagesinquan2titativeproteomics.Theapplicationandthelatestprogressesaboutthistechniquearedis2cussed.

Keywords:proteomics;stableisotopelabeling;MS;quantitativeanalysis 蛋白质组通常定义为一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质[1]。由于剪切方式的变化和翻译后的修饰,使得蛋白质组研究比基因组更加复杂,增加这种复杂性的另一因素是蛋白质丰度随环境变化而变化,即蛋白质为适应环境自身长期进化或环境应激而发生的改变。通过了解这些功能活动变化的过程,或许

可以揭示为什么/健康0细胞有别于/疾病0细胞和细胞为什么有不同的行为方式。蛋白质组学研究的一项关键内容,是在对比环境下对蛋白质的差异表达进行准确的定量分析,通过比较正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平的差异,进而找到此环境下密切相关的差异蛋白所引发的疾病,从而确定多种致病因子在对机体作用时最

收稿日期:2005201227;修回日期:2005207228

作者简介:孟丽丽(1977~),女(汉族),河北人,硕士生(导师:齐孟文),从事核技术应用与酶联免疫试剂盒开发

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重要的靶分子,为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据。

过去,主要采用二维差异凝胶电泳(DIGE)技术分析蛋白质的差异表达。近年来发展起来的一种稳定同位素标记(StableIsotopeLabe2ling)及质谱分析技术,因其使用稳定同位素标记,使得质谱检测更具特异性,加之质谱分析固有的准确性和采用束流检测后的高度灵敏性,使其在低丰度蛋白质的分析中展现出良好的应用前景。

中N原子的数。通过比较质谱图中同位素标记内标物的一对峰的强度,便可确定对照细胞体系中蛋白质表达水平的差异。由于两对象测定是在同一分析过程下完成的,因此具有很高的准确性;同时内标质谱法的信噪比高,测定灵敏度也较高。

Annemieke等

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用酿酒酵母作为实验对象,

在设定的实验条件下,于发酵罐中在两种不同的单一营养限制条件下进行酵母繁殖,用硫酸氨(NH4)2SO4作为唯一的氮源,一种培养液富含15N,另一种是正常的培养液。繁殖一段时间后,破碎细胞并抽取蛋白质,在标本混合前用不同的荧光分子CyDyes进行荧光标记,二维凝胶电泳分离,酶解,用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI2TOFMS)进行鉴定。然后将两种酵母细胞混合并破碎后,采用二维差异凝胶电泳(DIGE)和稳定同位素代谢标记技术(Met2abolicStableIsotopeLabeling)在少量的但具代表性的蛋白位点进行观察对比。结果显示,两种方法的相关性很好,相关系数达到0.89。

Oda等[5]将S.啤酒酵母细胞分别置于正常及富含15N的介质中培养一段时间后,将分别培养的细胞混合,采用反相液相色谱柱分离,收集到的组分再进行SDS2PAGE凝胶分离,酶解后,对得到的肽段进行质谱分析。结果表明S.啤酒酵母中有42种高丰度蛋白在表达G1cyclinCLN2时显示出明显差异。同时Oda等运用这种方法准确定量了蛋白质在不同生长条件下表达量的变化。

在传统的蛋白质研究中,质谱只能应用于蛋白质的鉴定,而不能用于定量分析,这是因为不同的蛋白质或多肽具有不同的离子化率,而用同位素标记差异质谱巧妙地解决了这个问题。但该方法也有其不足之处。如,该方法是在细胞培养阶段进行同位素标记,所以不能直接对从组织中提取的细胞进行分析;富集同位素的介质可能会改变细胞生长中的某些过程,从而人为地改变蛋白质组的表达水平,有时可能不能真实反映细胞内蛋白质的表达情况;同位素试剂需要量较大,成本高;只能对已知序列的肽段进行定量分析,在对实际样品进行定量分析时,往往要求在定量分析前进行肽段结构鉴定,即氨基酸序列分析[6,7];同位素标记增加了被标记蛋白质的相对,[8]

1 技术介绍

近年来,基于质谱技术,稳定同位素标记技术定量分析蛋白质表达水平获得了很大进展。它是在两套对比标本中用同一核素的不同稳定性同位素标记蛋白或多肽。通常是用富含某种

l3l5l8

重质同位素(比如:2H、C、N、O)的试剂标记与被分析肽段相同的肽段作为其内标物,被分析肽段则与正常的同种试剂(即其中所有元素的含量皆为天然丰度)结合。内标肽段与被分析肽段(组成为一个/分析对0)除了在质量上相差确定的几个单位外,其他的物理、化学性质几乎完全相同,在标记后的诸多分离纯化过程中,其行为很相似,由于质量数的差异,在质谱图上表现为一对峰,峰的间距由内标物所含的重质同位素的个数决定。目前,各种不同的稳定同位素应用范围极广,而且在蛋白质组实验的不同阶段,它可以和化学方法或生物方法一起使用。稳定同位素标记技术主要有提取前标记方法(代谢标记方法)、提取后标记方法及反转标记方法[3]。1.1 代谢标记法

代谢标记方法是指利用培养细胞的代谢作用,将标记了核素的蛋白质掺入细胞内的方法。通常将一定量细胞种类相同、蛋白质表达水平不同的两个细胞样品,分别置于正常培养介质和富含某种重同位素的相同培养介质中进行标记。以N标记为例,经过一段时间培养,在富含N的培养介质中,生长繁殖的细胞内,蛋白质被标记。培养结束后,将在正常介质中生长繁殖的细胞和被N标记的细胞混合,破碎细胞,通过选择性亲和分离、色谱分离等过程提取相关蛋白质,进行消化酶解,使其成为肽段,最后进行质谱分析。来自两个对比细胞样本的每一肽段在质,15

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1.2 后加标记

后加标记法是指先将细胞或组织破碎,提取出相关待分析成份后,再用同位素进行标记。该方法通常用于标记来源不同、细胞状态相同的肽段, …… 此处隐藏：9519字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……