第二章蛋白质分子设计

化学

第二章 蛋白质分子设计

蛋白质分子设计

基于天然蛋白质结构的分子设计

蛋白质设计原理

蛋白质设计中结构与功能关系的研究

天然蛋白质剪接

全新蛋白质设计

蛋白质的从头设计

蛋白质设计的目的

为蛋白质工程提供指导性信息

探索蛋白质的折叠机理

简单蛋白质构建或骨架的从头设计是研究蛋白质相互作用的类型及本质的很好途径，为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律 。

蛋白质设计存在问题

设计的蛋白质与天然蛋白质相比缺乏结构的独特性极明显的功能优越性。

设计的蛋白质有正确的形貌、显著的二级结构及合理的热力学稳定性，但三级结构的确定性较差。

按照改造部位的多寡分为三类：

第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现； 第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；

第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质。

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蛋白质的分子设计可分为两个层次

在已知立体结构基础上所进行的直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计工作 在未知立体结构的情形下借助于一级结构的序列信息及生物化学性质所进行的分子设计工作。

蛋白质分子设计流程图

蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面 蛋白质来源：真菌、细菌、动物蛋白质和植物蛋白质 筛选以及纯化蛋白质需要测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等

一、蛋白质三维结构的判断

目前PDB(Protein Data Bank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。

1、对于已知三维结构的蛋白质：根据PDB中三维结构对蛋白质进行设计

2、对于未知三维结构的蛋白质：如果PDB中没有收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。

计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位臵。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至

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关重要的。

专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。

二、 蛋白质设计原理

①内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成

②所有蛋白质内部都是紧密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。 ③所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)

④ 疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。

⑤ 在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何，符合正确的键长、键角及整体的几何。

⑥ 对于金属蛋白，大部分配基含有多于一个与金属作用或形成氢键的基团。其余形成围绕金属中心的氢键网络，这涉及与蛋白质主链、侧链或水分子的相互作用。

⑦ 最优的氨基酸侧链几何排列。

⑧ 结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志。 蛋白质设计的目标及解决办法

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蛋白质突变体设计步骤

1）以蛋白质的三维结构为基础，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸

2）利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构

3）预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构-功能或功能-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质

注意的问题

A 应确定蛋白质折叠敏感的区域，包括带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区等。

B 应确定对功能非常重要的位臵。

C 考察剩余位臵对所希望改变的影响。

D 当进行互换或插入/删除残基是应考虑他们对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等。

三、蛋白质设计中的结构－功能关系研究 定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用。 突变蛋白质构象的探测

定位突变种类

插入一个或多个氨基酸残基

删除一个或多个氨基酸残基

替换或取代一个或多个氨基酸残基

最大量的定位突变是在体外利用重

组DNA技术或PCR方法

突变蛋白质结构的评估

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溶解性

热力学分析

Ｘ射线晶体学及ＮＭＲ谱

园二色散方法

单克隆抗体探测构象变化

结构与功能的容忍度

蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。

Fersht等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明23％的突变体保留了酶的活性

Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠

这些结果说明不同的氨基序列具有相近的设计的结构。

第二节 全新蛋白质设计

特征：

全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程，合成具有特异结构与功能的新蛋白质。根据所希望的结构及功能设计蛋白

质或多肽的氨基酸序列

蛋白质的全新设计

蛋白质结构的从头设计

蛋白质功能的从头设计

取得的进展：血红素结合蛋白、

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氧化还原活性蛋白质、DNA结合蛋白、

基于蛋白质的高分子材料

一、蛋白质结构的从头设计

中心问题：设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列

１．二级结构模块单元的自组装：

２．配体诱导组装

３．通过共价交叉连接实现肽的自组装

自然界唯一用于交叉连接的方法是二硫键。

４．在合成模板上肽的组装

在模板上组装合成蛋白的方法

特点：使用人工合成的模板代替天然蛋白中的连接二级结构的单元

模板：寡肽，可形成两个反平行β折叠链，设计一个Pro-Gly的转折。在链的两端设计一个二硫键，形成一个环状结构。

５．线性多肽折叠为球状结构

不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠成球形的确定的三维结构是蛋白质设计追求的目标之一

主要障碍：构象熵

实例:α-螺旋

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根据α-螺旋的两亲性。形成的α-螺旋显著稳定性是因为形成明显的疏水核，还有Glu 和Lys形成的盐桥，螺旋偶极的电荷中和，增加了在螺旋/转折连接处的柔性

二、蛋白质功能的全新设计

蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化

为达到这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质

蛋白质的功能设计

１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能 ２．键合及催化的从头设计

３．在全新蛋白质中引入结合位点

４．催化活性蛋白质的设计

５．膜蛋白及离子通道的设计

６．新材料的设计