病毒学 第七章：病毒基因

第七章：病毒基因工程第一节 病毒载体 第二节 病毒基因工程应用举例

本章重点1.几种重要的基因工程载体 2.噬菌体展示的原理

人们研究病毒，一方面是为了控制病毒性疾病，另

一方面也是为了利用病毒服务人类。1953年Watson和Crick发现了DNA双螺旋结构，开 创了分子生物学的新时代。 1970年H.M.Temin和D.Baltimore对RNA肿瘤病毒 反转录酶的发现，不仅使DNA复制的中心法则得以完

善和发展，同时使RNA反转录为cDNA成为实验室常规手段，也使基因工程这门学科得到了飞速的发展。

病毒基因工程就是利用重组DNA技术，以病毒为载

体，高效表达病毒基因及其它外源基因或者对病毒基因进行基因治疗及开展有关蛋白功能研究。

组进行改造，用于制备防治病毒性疾病的疫苗、杀虫剂、

第一节 病毒载体一、噬菌体载体

1、λ噬菌体线状dsDNA,总长度为48502bp,在DNA分子的两端

各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5’单链突出序列，即黏性末端。λ噬菌体DNA进入寄主细胞后，通过 两个末端互补结合形成黏性末端位点，使DNA环化，开 始复制。

λ噬菌体整个基因组可分为三个部分

①左臂：从A到J长约20kb,其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的结构蛋白质。 ②中段：长约20kb,位于基因J和N之间，是λDNA整合和 切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb,是调控区，控制溶菌和溶原生长最

重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。 左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组

装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。

2、λ噬菌体的缺陷与改造λ噬菌体的缺陷： ⑴ 基因组太大(49kb); ⑵ 酶切点太多，它有 5个 BamH1位点(G↓GATCC ), 6个 BgⅠ位 点(A↓GATCT),5个EcoRⅠ位点(G↓AATTC)。

⑶ 野生型只能接纳一定长度的DNA。接纳49kb×5%=2.45kb的 DNA。λ噬菌体的改造 λ噬菌体的改造

⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因(2.5kb或更 大); ⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； ⑶ 增加标记基因(remarker gene)。

(1)插入型载体：

λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用 于cDNA文库或基因组文库的构建，一般容许插入 5-7kb外来DNA。 cI基因插入失活： 如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及Hind III的酶 切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导 致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。 LacZ基因插入失活： 如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因 上有EcoRI位点，插入失活

后利用X-gal法筛选(兰白筛选)。

cI

LA 32.7λgt 10 lac Z

EcoR I

RA10.6

LA 19.9

EcoR I

RA21.9

Charon 16A

是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、 抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段， 其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。 在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框，但可使 少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用 于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片 段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段 的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然 而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补 能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的 筛选，又称为蓝白斑筛选。

(2)替换型载体：只有DNA的长度大于野生型的75%而

不超过105%,才能包装成噬菌体。插入外源基因20kb。

没有外源基因插入的噬菌体不能包装。(3)cos质粒：如果将左右臂和中段都去除，仅留下

λDNA两端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos 质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源

DNA,然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖

而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。

2、丝状噬菌体大肠杆菌的M13噬菌体为单链环状DNA M13噬菌体的生物学特性：

M13噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和 正链DNA组成。DNA全长6407个核苷酸，基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质， DNA上有11个基 因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔 位于基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间， 其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。成熟的 噬菌体只感染雄性大肠杆菌， M13噬菌体不裂解宿 主细胞，但抑制其生长。 2700个外壳蛋白分子

M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质: 复制蛋白(基因 Ⅱ,Ⅴ 和 Ⅹ) 形态发生蛋白(基因Ⅰ,Ⅳ 和 Ⅺ) 结构蛋白(基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、 Ⅷ 和 Ⅸ )。 基因组 DNA 为正链，按基 因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，与 噬菌体的 mRNA 序列同义。