大肠杆菌K12植酸酶热稳定性突变体在毕赤酵母中的高效表达和性质

田d o i: 1 0 . 3 9 6 9/ j . i s s n . 1 6 7 2—5 4 2 5 . 2 O 1 3 . 0 2 . 0 0 9

2 0 1 3, V o I . 3 0 N o . 2亿亏与生物互程Ch e mi s t r y& Bi o e n g i n e e r i n g

Hi g h - - Le v e l Ex p r e s s i o n a n d Cha r a c t e r i s t i c s o f AThe r mo s t a bl e Phy t a s e M ut a nt f r o m

Es c he r i c h i a Cl D Z Z K1 2 i n Pi c hi a Pa s t o r i sZHOU Yu - l i ng。 ZOU Yo u,FU Li n g, J I ANG We i, ZHAN F e i。 x i a ng KANG Li— x i n, M A Xi a n g - d o n g,M A Li - x i n

( H“ b e K8 y L“ 6 0 r a t o r y o f I n d u s t r i a l B i o t e c h n o l o g y, C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,H ub e i Uni v e r s i t y, Wu h an 4 3 0 06 2, Chi n a)Ab s t r a c t: P h y t a s e i s wi d e l y u s e d a s a f e e d a d d i t i v e i n i n d u s t r y . He r e b y i n t r o du c i n g a mu t a n t Ap p A NR d e r i v e d f r o m E f^ e r i f^ 口c D l i K1 2 a n d o p t i mi z i n g i t s c o d o n u s a g e b a s e d o n t h e p r e f e r r e d c o d o n s o f Pi c h i a p a s t o r i s t h e g e n e wa s s y n—.

t h e s i z e d b y t wo . s t e p P CR, a n d t h e n c l o n e d i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r p HBM 9 0 5 A. A h i g h - l e v e l e x p r e s s i o n r e c o mb i n a n t

P.抛s细r GSl l 5/ A

p p A NR wa s s c r e e n e d. wi t h t h e y i e l d o f 1 0 mg mL一’a n d t h e a c t i v i t y o f 9 8 0 U’mL~. Th e r e c o m—

b i n a n t D h y t a s e w a s h e a t e d a t 9 5℃ f o r 1 0 mi n, a n d s t i l l r e ma i n e d 9 0%o f i t s a c t i v i t y, w h i c h w a s mo r e t h e r m o s t a b l e t h a nt h e wi l d t y p e。 Ap p A. Me a n wh i l e, t h e e n z y me e x h i b i t e d b r o a d p H v a l u e s t a b i l i t y f r o m 1 . 5 t o 8 . 0 a n d wa s r e s i s t a n t t o p e p—

s i n . Al l t h e s e i mp r o v e me n t s ma d e i t p o s s i b l e t o b e u s e d a s a f e e d a d d i t i v e i n t h e f e e d i n d u s t r y .Ke y wo r d s: t h e r mo s t a b l e p h y t a s e; g e n e s y n t h e s i s; h i g h— l e v e l e x p r e s s i o n; e n z y me c h a r a c t e r i s t i c s

P h y t a s e i s a n i mp o r t a n t e n z y me u s e d a s a n a d d i— t i r e i n a n i ma l f e e d . Th e e n z y me c a t a l y s e s t h e s e q u e n— t i a l h y d r o l y s i s o f p h y t a t e( my o— I n o s i t o l 1, 2, 3, 4, 5, 6一 h e x a k i s p h o s p h a t e, I P6 )p r e s e n t i n p l a n t ma t e r i a l t ol e s s p h o s p h o r y l a t e d m y o— i n o s i t o l d e r i v a t i v e s wi t h

p o

r t e d t o d e mo n s t r a t e t h e g r e a t e s t s p e c i f i c a c t i v i t y c o mp a r e d wi t h t h o s e f r o m o t h e r mi c r o o r g a n i s ms a n d h a d b e e n s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d i n E. c o l i[, Pi c h i a p a s t o r i s[ ' ] a n d S t r e pt o my c e s l i v i d a n s[ H owe v e r, a.

p h y t a s e mu t a n t d e r i v e d f r o m E. c o l i K1 2 c o n t a i n i n g

c o n c o mi t a n t r e l e a s e o f i n o r g a n i c p h o s p h a t e[ .Th e p h o s p h a t e i s ma d e a v a i l a b l e t o mo n o g a s t r i e a n i ma l s,s u c h a s p i g s, c h i c k e n s a n d f i s h e s,wh i c h d o n o t p r o—

e i g h t a mi n o a c i d s u b s t i t u t e s, f o r wh i c h t h e a c t i v i t y a n d t h e r mo s t a b i l i t y i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y c o mp a r e dwi t h t h e wi l d t y p e . wa s o f l i t t l e c o n c e r n e d[ 8 j . I n o r d e r t o i n c r e a s e t h e e x p r e s s i o n l e v e l a n d f i n d o u t t h e p r o p e r t i e s o f t h i s p h y t a s e, h e r e, we d e s c r i b e d t h e g e n e s y n t h e s i s a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f p u r i f i e d, g l y—c o s y l a t e d p hy t a s e,Ap pA NR, a n d i t s e x pr e s s i o

n i n P. pas t o r i s .

d u c e p h y t a s e a n d a l s o t h e i r mi c r o f l o r a c a n n o t d e g r a d e p h y t a t e . Th i s e l i mi n a t e s t h e n e e d f o r e x t e r n a l a d d i—t i o n o f p h o s p h o r o u s t o t h e f e e d, wh i c h i n c u r s c o s t s a n d a l s o c o n t r i b u t e s t o e n v i r o n me n t a l p o l l u t i o n . Ma n y p h y t a s e s f r o m a n i ma l s,p l a n t s a n d m i— c r o b e s h a d b e e n i s o l a t e d a n d e mp l o y e d a s f e e d a d d i—

1 Ex p e r i me ntt i r e s . I n o r d e r t o o b t a i n p h y t a s e s wi t h h i g h a c t i v i t y o r t h e r mo s t a b i l i t y, p h y t a s e g e n e s f r o m Es c h e r i c h i a c o—1 .1 S t r a i n s, c he mi c a l a g e n t s, e n z y me s, a n d me d i a

l i t, B a c i l l u s s p .嘲， As p e r g i l l u s n i g e r[ ]a n d s o o n we r e c l o n e d a n d e x p r e s s e d .Am o n g t h e s e p h y t a s e g e n e s, t h e E. c o l i p h y t a s e g e n e ( Ap p A)h a d b e e n r e—

Pi c h i a p a s t o r i s GS 1 1 5 a n d t h e v e c t o r, p M D1 8一

T. we r e f r o m I n v i t r o g e n ( US A) .p HBM g 0 5 A wa s s t o r e d i n o u r l a b o r a t o r y￣。’。 .S o d i u m p h y t a t e wa s

基金项

目：国家自然科学基金资助项目 ( 3 1 2 4 0 0 0 8 ),湖北省教育厅资助项目 ( Q 2 0 1 0 1 0 0 2 ) 武汉市科技攻关计划项日( 2 o 1 l 2 0 7 2 2 2 1 6 - 2 )

收稿日期： 2 0 1 2—1 1—2 8 作者简介：周.￣ ( 1 9 7 5一),女，陕西汉中人，博士，讲师，主要从事生物化学与分子生物学研究， E ma i l: z y 1 6 0 9@s i n a c o m;通讯作者：马立新，教授， E - ma i l:l i x i n ma h d@y a h o o . c a。