绿色荧光蛋白研究的三个里程碑——2008年诺贝尔化学奖简介

ＢｒｉｅｆＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＮｏｂｅｌＰｒｉｚｅＣｈｉｎｅｓｅ

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒｅ

Ｖ０１．３０Ｎｏ．６

绿色荧光蛋白研究的三个里程碑

——２００８年诺贝尔化学奖简介

崔志芳①

邹玉红②

季爱云③

①副教授，②讲师，③硕士研究生，山东科技大学化学与环境工程学院，青岛２６６５１０关键词

诺贝尔化学奖绿色荧光蛋白报告基因

２００８年ｌＯ月８日，美国科学家下村修、马丁 查尔非以及钱永健因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面的突出成就而获得２００８年度诺贝尔化学奖。笔者拟对绿色荧光蛋白的研究历程以及应用领域做一些粗浅介绍。

２００８年１０月８日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将２００８年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（ＯｓａｍｕＳｈｉｍｏｍｕｒａ）、美国科学家马丁 查尔非（ＭａｒｔｉｎＣｈａｌｆｉｅ），以及美国华裔科学家钱永健（Ｒｏｇｅｒ

瑞舍一气之下，离开了科学界，将ＧＦＰ的ｃＤＮＡ送给了

几个实验室。很多人尝试用ＧＦＰ的基因来表达蛋白，但都失败了。哥伦比亚大学的马丁 查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。他用ＰＣＲ的方法扩增了ＧＦＰ

Ｙ．Ｔｓｉｅｎ）。他们三人在发现绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ

ｒｅｓｃｅｎｔ

ｆｌｕｏ—

的编码区，将它克隆到表达载体中，通过ｕＶ或蓝光激

发，在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是ＧＦＰ作为荧光指示剂的真正突破，文章发表在Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志上。这个实验的重要意义是证明了从水母上分离出来的ＧＦＰ基因可以在其他物种上表达，正确地折叠，发出荧光。这些研究成果为ＧＦＰ在生物学研究上的使用，奠定了基础。

ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）方面作出突出成就。

ＧＦＰ大家都不陌生，细胞中散发着点点绿光，煞是

好看。１９６２年被发现，１９９２年被克隆，中间隔了３０年。而它在生物界中被广泛应用，也就是这十几年的事。ＧＦＰ的具体研究历程到底是怎样的？

当时如果要研究活体生物中的生命活动，可以采用

１

ＧＦＰ研究的三个里程碑

１９６２年，下村修和约翰森从维多利亚多管水母（Ａｅ．

往细胞体内注射荧光化合物，或者是事先把荧光化合物

结合到蛋白上，然后注射到细胞内的方式。钱永健此时已经是这个领域的专家，他发明的荧光化合物ｆｕｒａ．２会随着周围钙离子浓度变化而改变荧光强度，经常被用来研究活体细胞内的钙离子浓度变化。但是这种方法的

ｑｕｏｒｅａ

ｖｉｃｔｏｒｉａ）中分离生物发光蛋白——水母素（ａｅｑｕｏｒ．

ｉｎ）时，意外地得到了一个副产物［１］１。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研

究了其发光特性。来源于水母的野生型ＧＦＰ在３９５

缺点也很明显：第一荧光化合物可能有毒性，影响正常

生理活动；第二把荧光化合物特别是标记了荧光化合物

ｈｉｌｌ

和４７５ｎｌｎ分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在

５０９

的蛋白注射到细胞内，需要特别的设备和专业训练——微注射；第三即使荧光化合物无毒，也有微注射的条件，

每研究一种蛋白，就必须先分离蛋白，然后找到标记荧光化合物的办法。这些困难，限制了普通生物学家研究活体生物活动的能力。

与此同时，分子生物学在ＰＣＲ技术的发展推动下，已经有了很强的操纵基因的能力。比起蛋白来，在ＤＮＡ水平上对基因进行裁接和修饰已经是实验室常规操作。如果ＧＦＰ可以在各个物种中准确折叠发出荧光，那么只要在基因水平上把研究者感兴趣的蛋白基

ｎｎｌ，处于可见光谱的绿色区域。１９７４年，他们得到了

这个蛋白，当时称为绿色蛋白，之后改称绿色荧光蛋白

（ＧＦＰ）。ＧＦＰ在水母中之所以能发光，是因为水母素和ＧＦＰ之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到ＧＦＰ，刺激ＧＦＰ发光。这是物理化学中已

知的荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）在生物中的发现。

当时的研究者们并没有意识到ＧＦＰ的应用前景，

慢慢就将其遗忘了。这一晃就是２０年。直到１９９２年，

道格拉斯 普瑞舍［２］克隆并测序了野生型的ＧＦＰ，文章发表在Ｇｅｎｅ杂志上。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不愿提供经费。普

３２４

因，接上ＧＦＰ基因，然后转移到细胞内表达，就等于给

被研究的蛋白带上了一个荧光标签。这一切完全不涉

万方数据　

自然杂志３（）卷６期

及蛋白提纯、标记、蛋白微注射等技术，也就是说，任何一个分子生物学家都有可能用荧光标记自己研究的对

象。而且ＧＦＰ是一种无害无作用的蛋白，不用担心对细胞产生毒性。

尽管野生型ＧＦＰ发出很绚丽的荧光，但它还是有

不少缺点，比如有两个激发峰，光稳定性不好，在３７℃不

能正确折叠等。此时，钱永健便利用他在活体荧光研究方面的丰富经验，对ＧＦＰ进行改造［３，４］，首个重大改变就是钱永健在１９９５年完成的单点突变（￥６５Ｔ）。这个突变显著提高了ＧＦＰ的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的ＧＦＰ激发峰转移至４８８ｒｉｍ，而发射峰仍保持在５０９ｎｍ，可与常用的异硫氰酸荧光素

（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）滤光片匹配，从而提

高了ＧＦＰ的应用潜力。Ｆ６４Ｌ点突变改善了ＧＦＰ在３７℃的折叠能力，在ＧＦＰ的基础上进行Ｆ６４Ｌ和Ｓ６５Ｔ的突变则形成增强型绿色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ

ｇｒｅｅｎ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ

ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）。ＥＧＦＰ不仅提高了荧光强

度，更重要的可以在普通的荧光显微镜下用现有的荧光

滤镜进行观察，而且光谱单一，不会和其他荧光染料的

光谱发生干扰，更容易观察、检测。

其他的突变还包括颜色突变，而这其中大部分也是钱永健的功劳（图１，见封二）。现在有蓝色荧光蛋白（ＥＢＦＰ，ＥＢＦＰ２，Ａｚｕｒｉｔｅ，ｍＫａｌａｍａｌ）、青色荧光蛋白（ＥＣＦＰ，Ｃｅｒｕｌｅａｎ，ＣｙＰｅｔ）和黄色荧光蛋白（ＹＦＰ，Ｃｉｔ－ｆｉｎｅ，Ｖｅｎｕｓ，Ｙｐｅｔ）。蓝色荧光蛋白除ｍＫａｌａｍａｌ外，都包含Ｙ６６Ｈ替换。青色荧光蛋白则主要包含Ｙ６６Ｗ替换。ＹＦＰ衍生物是由Ｔ２０３Ｙ突变实现的。不同颜色不是为了好看，而是为了可以同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构，或者是在研究中把ＧＦＰ标记蛋白与其他荧光化合物同时使用。多种颜色ＧＦＰ的出现，还为以后研究蛋白之间的相互作用，蛋白分解等提供了无限的可能性。生物学家可以同时对多种基因进行荧光标记，然后根据活体内的荧光颜色变化，判断生物活动进程，此时的荧光标记不再是标记蛋白在哪里，还能标记活体内的生物事件。现在世界各地实验室使

用的ＧＦＰ，都是经过改造优化了的，而钱永健是这方面

的先驱和领先人物。

２

ＧＦＰ的分子结构和发光机制．

ＧＦＰ的结构以及发光原理，要到１９９０年代通过Ｘ

射线晶体衍射才得以阐明。１９９６年Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ小组最先在Ｓｃｉｅｎｃｅ上发布了ＧＦＰ的￥６５ …… 此处隐藏：11588字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……