新型重组α型干扰素原核表达载体的构建、表达及活性检测

目的：合成一种新型重组α型干扰素(IFN-α)基因序列, 使其在大肠杆菌中表达, 并检测其生物活性.方法：人工合成新型重组IFN-α基因全长, 将PCR扩增产物与pUC18进行双酶切后构建克隆载体, 并转化至大肠杆菌, 经蓝白斑筛选, 提取质粒, 以EcoR I和BamH I双酶切, 插入表达载体pBV220, 转化至大肠杆菌, 42℃热诱导表达目的蛋白.超声破菌, 抽提复性后以Sephacryl S-200HR分离获得目标

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I S S N1 0 0 7—8 7 3 8细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l l Mo l I mm u n o 1 ) 2 0 0 7, 2 3 ( 4

论著

文章编号： 1 0 0 7— 8 7 3 8 ( 2 0 0 7 ) 0 4— 0 3 7 4— 0 3

新型重组 0【型干扰素原核表达载体的构建、表达及活性检测韩全利 ,张希东 ,金晓维，贾 敏，杨淑梅，尹春香 (空军总医院：干部病房三区， 肝胆外科，北京 1 0 0 0 3 6 )[摘要] 目的：合成一种新型重组型干扰素 ( I F N— )基因序列，使其在大肠杆菌中表达，并检测其生物活性。方法：

酸序列完全一致。本研究旨在建立新型重组 I F N— o t 的稳定高效的原核表达体系，摸索适合于后续生产应用的生产工艺流程，为新型基因工程人 I F N . o t的产业化打下基础。1材料和方法1 . 1材料 D H 5 菌株由军事医学科学院二所赠送。质粒p U C 1 8、 p B V 2 2 0由中国预防医学科学院赠送。转染有乙型肝

人工合成新型重组 I F N - 基因全长，将 P C R扩增产物与p U C 1 8进行双酶切后构建克隆载体，并转化至大肠杆菌，经蓝白斑筛选，提取质粒，以 E c o R I和B a mH I双酶切，插入表

达载体 p B V 2 2 0,转化至大肠杆菌， 4 2￣ C热诱导表达目的蛋白。超声破菌，抽提复性后以 S e p h a c r y l S - 2 0 0 H R分离获得目 标蛋白。在转染有乙型肝炎病毒基因的人肝癌细胞系 2 . 2 . 1 5 细胞中，研究其对 H B s A g和 H B e A g的分泌的影响。结果：重组质粒读码框经测序与预期一致，表达产物经 S D S— P A G E分

炎病毒 D N A的人肝癌细胞的 2 . 2 . 1 5细胞系由美国 M o u n t S i n a i医学中心构建，引进后自行传代培养。T 4 D N A连接酶、 T a q D N A聚合酶、限制性内切酶购自P r o m e g a公司；核酸分子量标准酶切片段及低分子量蛋白标准购自原平皓生物公司；H B s A g、 HB e A g固相放免测定盒购自中国同位素公司。重组干扰素干复津为美国 A m g e n公司产品。1

. 2方法

析获得证实，与2 . 2 . 1 5细胞培养 8 d,对H B e A g和H B s A g的分泌具有一定的抑制作用。结论：成功地构建原核表达载体 p B V 2 2 0一 I F N—,并使其在大肠杆菌中获得融合表达，重组表达的新型重组 I F N -具有抗病毒作用。[关键词]重组干扰素；原核表达；抗病毒效应[中图分类号] Q 7 8 6; R 9 7 8 . 7 [文献标识码] A

1 . 2 . 1新型重组 I F N—基因的克隆

将所设计的全长 D N A

o t干扰素 ( I F N - o t )具有抗病毒、抗肿瘤、抑制细序列分为大致相等的 8个片段，正、反向链各 4个 (表 1 ),相胞增殖以及提高免疫功能等作用，广泛应用于治疗邻的片段的两端重叠或互补，首先分别合成 8个片段，然后C R方法连成完整分子，P C R引物序列如表 1所示， 某些病毒性疾病，如病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿应用 P

疣 I 4 ;以及用于治疗某些肿瘤，如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非何杰金

P C R条件为： 9 4℃变性 5 m i n;然后 9 4℃变性 3 0 S、5 0 o C退火 3 0 m i n、7 2￣ C延伸 6 0 S,进行 3 5个循环；最后 7 2￣ C延伸 1 0m i n。回收后的 P C R片段用 E c o RI、 B a mHI双酶切，然后与同样酶切的质粒 p U C 1 8连接，转化到 D H 5 c￣受体菌，蓝白斑

氏淋巴瘤、恶性黑色素瘤和肾细胞癌等， 。I F N . o t 主要由白细胞产生，所有的 I F N . o t生物作用相似，但

筛选获得阳性转化子，摇菌并提请质粒，然后进行测序鉴定。

每一种 I F N - o t并不具有全部活性，每一种干扰素亚 1 . 2 . 2构建原核表达质粒 p B V 2 2 0/ I F N c o及重组子的筛选和型的活性程度差别很大。新型重组 I F N . o t是一种重鉴定将含全合成的人新型重组 I F N— ( A r g )基因片段的组的、非自然存在的 I F N - o t,新型重组 I F N. o t氨基酸 p U C 1 8重组质粒和原核表达质粒 p B V 2 2 0用 E c o R I和B a mH I低溶点琼脂糖电泳分离片段，回收 D N A。将 p B V 2 2 0 序列的

取得是通过对几种天然 I F N - o t序列进行扫描， 双酶切， F N—基因片段分别进行琼脂糖电把最常见的氨基酸转移到各个对应的位置。新型重双酶切片段与新型重组 I按等摩尔混合，T 4 D N A连接酶 1 2—1 6℃连接反应过夜。 组I F N - o t显示的体外特异性活性比 o t - 2 a和 o t - 2 b干泳，取5 连接物转化 D H 5 c￣感受态细胞。氨苄青霉素筛选，对初筛的阳性克隆，提取质粒对重组子进行 P C R鉴定。 1 . 2 . 3诱导表达及其产物的纯化复性将D I - I S c￣接种于 L B

扰素至少大 5倍以上，在抗丙型肝炎及乙型肝炎方面，新型重组 I F N— o t也显示了非常有效的治疗作用。

培养基中， 3 2￣ C下培养过夜， 4 2￣ C温控诱导。冰浴条件下超

在本研究中，所合成的重组 I F N - d是也一种新型声破碎，离心，用缓冲液反复冲洗沉淀去除可溶性胞内蛋白 重组 I F N - o t,其第 1 2 2位氨基酸从赖氨酸更换为精氨及核酸，用低浓度的表面活性剂洗涤。将沉淀混悬后，用酸，其余的氨基酸序列与已发表的重组 I F N . o t氨基 8 m o l/ L尿素缓冲液缓慢加入沉淀悬浮液中，使尿素终浓度为收稿日期： 2 0 0 6— 0 7—0 7;接受日期： 2 0 0 6— 0 8—2 4

1 m o l/ L。应用抽提液对沉淀悬浮液进行抽提，以溶解包涵

作者简介：韩全利 ( 1 9 7 1一),男，山西文水人，主治医师，博士Te l:01 0 - 6 6 92 8 1 3 2;E— ma i l:h a n q u a n l i@ 21 c n . c o m

体。然后应用透析法对蛋白质进行复性，复性蛋白质浓度为< 0 . 2 5 m g/ m L,一共进行3次透析，前2次透析缓冲液为