Bio-Rad定量PCR说明书

Bio-rad实时荧光定量PCR仪

BIO-RAD Gene Expression Division

Outline Real Time PCR and Conventional PCR Introduction to Quantitative PCR Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory Laboratory Technique Primer Design for Real-Time PCR

Real Time PCR and Conventional PCR

技术背景 本来，PCR技术是为了将样本中微量的DNA模版放大 以便研究模版特性 随着研究的深入，需要了解样本中基因的表达模式 与疾病的关系，这就要了解标本中的DNA原始拷贝 数。

常规 PCR Process3’ 5’ 5’ 3’

Denaturation Primer Annealing Elongation

3’

Taq Taq

5’

5’

3’

Repeat

In theory, product accumulation is proportional to 2n, where n is the number of amplification cycle repeats

Reality vs. TheoryAmplification is exponential, but the exponential increase is limited:

Log Target DNA

A linear increase follows exponential Eventually plateaus

Theoretical

Real Life

Cycle #

常规PCR方法的局限性分析： 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进 行分析 对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰， 定量准确度难以提高(相对误差>1000%); 存在扩增产物的污染问题。 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而 且EB有毒 无法对扩增反应实时检测

PCR: Theory vs. Reality C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.End Point

Cycle

Real-Time PCR实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”,最后通 过Ct值和标准曲线对样品中的未知样品 的起始浓 度进行定量的方法。

Quantitative PCR /Real time PCR Quantitative PCR 或 Real time PCR 是确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝 数最敏感、最准确的方法

PCR: Theory vs Reality C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.End Point

C(t)

Cycle

定量的最佳时期Theoretical

Log Target DNA

Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification.

Detector

Real Life

Cycle #

常用的定量方法 相对定量：相对于另一参照样本的量； 绝对定量：用标准品作标准曲线来推算未知的 样本的量。

Quantitative PCR和常规PCR技术的区别 常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进 行定性分析(定量不准确); Quantitative PCR是在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，使每一个循环变得“可见”,通过Ct值 和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始 浓度进行定量的方法(准确定量) 。

Introduction to Quantitative PCR

PCR仪 + 监测、分析系统 + 荧光标记

定量PCR仪应该具备的特点：杰出的温度控制

采用半导体加热和制冷

加热速度 3.3°C /秒 ，制冷速度 2°C/秒 升降温速度可调 控温准确性：±0.3℃