二次回归正交组合设计与综合相关系数法对耐热纤维素酶基因工程菌(2)

对因素码z＝————，对xXj的各个水平进行线性变换，得到水平的编j－xj0

j合设计试验Δ4个因素进行四元二次回归正交组

j

[10-12]。

表２　　　四元二次（１／２实施）回归正交组合设计试验方案及结果Table 2 Arrangement and results of quadratic regression

orthogonal composite design

试验号 因素 酶活性/(U/mL)

Z1诱导剂Z2碳源Z3氮源Z4钙质量浓度 Y1实际值Y2预测值

1111136.736.3211－1－139.238.831－11－139.238.841－1－1136.736.35－111－139.639.66－11－1142.142.17－1－11142.142.18－1－1－1－139.639.69　　γ00038.639.510 －γ

00044.444.2110　γ0042.442.9120－γ0042.742.91300γ042.743.01400－γ042.743.015000γ40.242.416000－γ44.042.417000046.545.918

46.5

45.9

1.2.4.2综合相关系数分析法

设有变量组X1, X2,…, Xn与变量组Y。每个变量有m个观测值，实验中n=4，m=18。

1)主成分的求解与合成[13]

可求解出变量组X1,X2,…,Xn的主成分F1,F2,…,Fn，特征值λ1,λ2,…,λn，方差贡献率(B)：

λ1 　λ2 λn

B＝(——, ——, …, ——)＝( n

∑

λn

n

b1, b2, …, bn) (1)

i=1

i 　i=1

∑λi i∑=1

λiF＝F1b1+F2b2+…+Fnbn＝C1X1＇+C2X2＇+…+CnXn＇ (2)F被称为变量组X1, X2, …, Xn的合成主成分，X1＇,X2＇, …, Xn＇为X1, X2, …, Xn标准化处理后的数值。其中：Ci＝bi(a1i+a2i+…+ani) (3)Ci反映了Xi在X1, X2,…, Xn中的重要性，称为影响系数。令变量Y影响系数矩阵T＝(Ti)。

2)综合相关系数的求解及其分解

设变量组X1, X2,…, Xn与变量Y直接相关系数矩阵为r，令C＝diag(C1, C2, …, Cn)，T＝(Ti)，F与变量Y的综合相关系数为1

Rn

可分解为：

R＝TrC＝∑ ∑TirijC其中Ti=1j=1

j (4)

irijCj表示变量Y与变量Xj的综合相关系数，它包含了直接相关系数rij，也包含了变量Y与变量Xj各自的影响系数Ti和Cj，称为变量综合相关系数。

Y与变量组n

X1, X2,…, Xn的综合相关系数：

Ri(1)＝∑TirijC以上计算，采用统计分析软件j=1

j (5)

SPSS15.1和工程计算软件MATLAB2007编程处理。２结果与分析

2.1

内切纤维素酶发酵条件优化

在确定诱导时机为OD540nm值达0.6、诱导时间为4h、初始 pH值为7、菌株生长阶段温度37℃、诱导阶段32℃，接种量为1.5%的条件下，对影响基因工程菌内切纤维素酶表达的几个主要因子(诱导剂(乳糖)剂量、碳源(麸皮)浓度、氮源(硫酸铵和玉米浆)浓度、钙离子(碳酸钙)质量浓度，采用四因素五水平二次回归正交组合设计试验，结果见表2。

利用MATLAB7.0软件，对表2数据进行二次多元回归拟合，通过逐步回归法，得到酶活性Y2与四因素Z1、Z2、Z3、Z4之间的二次回归方程：

Y2=45.858－1.653Z1－1.258Z2Z3－2.012Z12－1.499Z22－1.415Z32－1.719Z42 (6)

回归相关系数0.964，F=24.42，P＜0.0001，说明回归方程极其显著。

利用回归方程(6)，进行预测，预测值见表2。从预测值与实测值得对比来看，也说明回归模型与实际情况拟合的很好。对回归方程(6)求导，解逆矩阵分析表明：Z1＝－0.41，Z2＝0，Z3＝0，Z4＝0时，Y2= 46.5357。

依据zxj－xj0

j＝————，可得对应的变量Δj

X的值：X1＝

※生物工程食品科学

2010, Vol. 31, No. 03163

15.9，X2＝10，X3＝15/5，X4＝1.0时，Y2取得最大预测值46.5357。在回归方程(6)中，各项的系数均极其显著。2.2

验证性实验

在最优化条件下(诱导剂X1=15.9g/L，碳源X2=10g/L，氮源X3=15/5g/L，钙质量浓度X4=1.0g/L)，进行纤维素酶的产酶动态实验。内切纤维素酶基因工程菌的生长和产酶是不同步的，在未经乳糖诱导时，菌体生物量大量增加，但产酶水平是非常低的；当加入乳糖时，菌体迅速开始产酶，诱导时间约为4h，产酶量达70.78U/mL。2.3

综合相关系数分析法结果

根据表1和表2的数据，实验4个因素的影响系数

C为－0.9566、－0.8454、－0.6672、0.7441。酶活性Y的影响系数：T＝1。酶活性Y与4个因素间的直接相关系数为－0.406、－0.051、－0.138、0.066。由表3可知，酶活性Y与4个因素间的的综合相关系数为Ri(1)=0.710，P＜0.05，表示变量Y与变量Xj的综合相关系数TirijCj、变量Y与变量组X1, X2,…, Xn系数R(1)＝∑n

的综合相关

ij=1

TirijCj。

表３　　　酶活性和４个因素之间的综合相关系数

Table 3 Integrated correlation coefficients between cellulose

activity and four experimental factors

项目 TirijCj

X1X2X3X4Ri(1)综合相关系数0.388

0.043

0.230

0.049

0.710*

注：*.P＜0.05。

由4个因素的影响系数C可知，可以对酶活性Y起间接作用的大小依次为：诱导剂X1、碳源X2、钙浓度X4和氮源X3。

由Y与4个因素的直接相关系数r可知，可以对酶活性Y起直接作用的大小依次为：诱导剂X1、氮源X3、钙浓度X4和碳源X2。

由表3可以看出，4个因素对酶活性Y的综合影响大小为：诱导剂X1＞氮源X3＞钙浓度X4＞碳源X2。2.4

质粒稳定性和酶活稳定性分析

将基因工程菌用连续点种法37℃继代培养，以考察所含纤维素酶基因的质粒在宿主中的稳定性。结果显示，经连续转接16次，工程菌质粒的稳定性为98%。此外，将培养后的细胞重悬在PBS溶液中，于4℃放置35d，细胞仍保持90%以上的酶活性，说明该基因工程菌具有较高的质粒稳定性和酶活稳定性。３

结　　论

通过以上分析，可以得出以下基本结论：3.1

二次回归正交组合试验分析表明，发酵培养基对提

高内切纤维素酶活性的最佳条件为：诱导剂X1=15.9g/L，碳源X2=10g/L，氮源X3=15/5g/L，钙质量浓度X4=1.0g/L，理论预测酶活性最值为46.5357U/mL。在理论最优条件下，验证性实验表明，菌体迅速开始产酶，诱导时间约为4h，产酶量达70.78U/mL。理论与实际相符。3.2

二次回归方程为：Y2=45.858－1.653Z1－1.258Z2Z3－2.012Z12－1.499Z22－1.415Z32－1.719Z42。方差分析也表明回归方程显著。依据回归方程进行预测，预测结果与实际非常相似。也说明二次回归正交组合实验应用是合理成功的。3.3

综合相关系数分析表明，4个影响因素的重要性依次为：诱导剂X1(乳糖)＞氮源X3(硫酸铵和玉米浆)＞钙质量浓度X4(碳酸钙)＞碳源X2(麸皮)。相互间通过交互对纤维素酶活性的间接影响都非常大，直接相关作用较小。综合相关系数分析与二次回归正交组合分析的结果基本一致，而且各有侧重，两者结合使用有互补性。3.4

通过连续16代培养，纤维素酶基因工程菌质粒较稳定，便于工业化生产。４

讨　　论

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