二次回归正交组合设计与综合相关系数法对耐热纤维素酶基因工程菌

160 2010, Vol. 31, No. 03

食品科学※生物工程

二次回归正交组合设计与综合相关系数法对耐热纤维素酶基因工程菌发酵条件的优化与分析

杜瑞卿1，吕文平2,*，王 丽1

(1.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南 南阳 473061；2.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

摘　　　要：目的：研究耐热纤维素酶基因工程菌的规模化生产。方法：采用二次回归正交组合设计试验对内切纤维素酶重组菌的发酵条件进行优化，利用综合相关系数分析法分析因素影响程度以及相对重要性。测定菌体生长的生物量、内切纤维素酶活性。结果： 影响因素与纤维素酶活性间的二次回归方程为：Y2=45.858－1.653Z1－1.258Z2Z3－2.012Z12－1.499Z22－1.415Z32－1.719Z42，方差分析具有显著性。内切纤维素酶重组菌产酶的最佳发酵条件为：添加15.9g/L 乳糖、10g/L麸皮、15g/L硫酸铵、5g/L玉米浆、1.0g/L碳酸钙；理论产酶量最好为46.5357U/mL；在诱导时间约为4h，实际实验酶产量达70.78U/mL。综合相关系数分析表明：4个影响因素的重要性依次为：诱导剂X1(乳糖)＞氮源X3(硫酸铵和玉米浆)＞钙质量浓度X4(碳酸钙)＞碳源X2(麸皮)，相互间通过交互对纤维素酶活性的间接影响都非常大，直接影响作用较小。 结论：通过使用综合相关系数分析与二次回归正交组合分析，两者结合使用有互补性，能够较好地指导耐热纤维素酶基因工程菌发酵条件的优化。关键词：耐热纤维素酶；响应面；综合相关系数；优化

Optimization of Fermentation Medium for Thermostable Cellulase Production by Engineered Bacteria UsingQuadratic Regression Orthogonal Composite Design Coupled with Integrated Correlation Coefficient Analysis

DU Rui-qing1，LU Wen-ping2,*，WANG Li1

(1. School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract ：Objective: To provide reference for large-scale production of thermostable cellullase by engineered bacteriafermentation. Methods: The optimal fermentation medium of recombinant Escherichia coli obtained from Clostridium thermocellumfor the production of thermostable cellullase were investigated using quadratic regression orthogonal composite design coupledwith integrated correlation coefficient analysis, where four factors and their relative importance were analyzed. Results: Thequadratic regression equation between four experimental factors and cellulose activity was presented as follows: Y2 = 45.858－1.653Z1－1.258Z2Z3－2.012Z12－1.499Z22－1.415Z32－1.719Z42. Variance analysis exhibited a significant difference. Theoptimal fermentation medium of the recombinant strain for the production of thermostable cellullase consisted of 15.9 g/Llactose, 10 g/L wheat bran, 15 g/L ammonium sulfate, 5 g/L corn syrup and 1.0 g/L calcium carbonate. The theoretical cellullaseactivity was 46.19 U/mL after 4 h of induction time. However, the actual cellullase activity was 70.78 U/mL. Integratedcorrelation coefficient analysis showed the importance of four factors according to the following order of inducer X1 (lactose)＞nitrogen source X3 (ammonium sulfate and corn syrup)＞calcium concentration X4 (calcium carbonate)＞carbon source X2 (wheatbran). The indirect effects from cross-interaction on cellulase activity were all larger than the direct effects. Conclusion: Thecombinatorial application of integrated correlation coefficient and quadratic regression orthogonal composite design exhibits acomplementary effect, which benefits the optimization of fermentation medium of recombinant Escherichia coli obtained fromClostridium thermocellum for the production of thermostable cellullase.收稿日期：2009-05-10

基金项目：国家自然科学基金项目(30972120)；南阳师范学院生物化学与分子生物学重点学科科研资助项目

作者简介：杜瑞卿(1968—)，男，副教授，硕士，主要从事实验设计优化和生物统计学研究。E-mail：duruiqing8@*通信作者：吕文平(1968—)，男，副教授，博士，主要从事食品营养与功能因子研究。E-mail：wplu@

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※生物工程食品科学

2010, Vol. 31, No. 03161

Key words ：Clostridium thermocellum cellullase；quadratic regression orthogonal composite design；integrated correlationcoefficient；optimization

中图分类号：S182 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)03-0160-05

世界上每年生成1500～2000亿吨植物性有机物，其中约一半为纤维素物质，如何将纤维素物质降解转化为糖、乙醇、甲烷等容易利用的小分子有机物是当前国际上的重大课题之一。 目前，对纤维素的降解利用主要采用酸碱化处理等化学手段，以及汽爆及蒸气加热等物理手段[1]。生物法由于对设备要求低，分解后的产物易回收利用，对环境污染较小等特点而备受重视[2-3]。

纤维素酶是一类将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，是一个复杂酶系，根据其功能的不同可分为3大类：作用于纤维素非结晶区的内切葡聚糖酶(又称CMCase)，作用于纤维素无定型区切割糖苷键的外切葡聚糖酶，以及作用于纤维二糖的葡萄糖苷酶。它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。现已广泛应用在纺织、能源、食品、饲料等工业。提高纤维素酶的热稳定性可提高反应温度，降低反应体系的黏度，提高底物浓度，加快降解速度，所以研究耐热纤维素具有重要的实用价值和广泛的应用前景[4-7]。

实验在前期构建了嗜热梭菌内切纤维素酶基因工程菌，该重组内切纤维素酶的最适温度为60℃，在70℃处理2min，酶的活性基本不受影响；酶的活性较高，发酵液中羧甲基纤维素酶活性为33.2U/mL。但该工程菌以进口的原料配制的LB培养基生长良好，而且诱导剂IPTG价格昂贵，大大增加了工业化生产成本。近年来，国内学者对大肠杆菌基因工程菌培养的诱导条件、培养基的优化、装瓶量、发酵温度、初始pH值和溶解氧浓度等进行了研究。笔者在上述研究文献的基础上，结合内切纤维素酶的特点以及规模生产的实际问题，选取4个因素：以乳糖为诱导剂、麸皮为碳源、硫酸铵和玉米浆为氮源、碳酸钙的钙离子质量浓度，进行四因素五水平二次回归正交组合设计分析，寻找最佳优化条件，再利用综合相关系数分析法，揭示各因素的影响程度以及因素间相互交互影响程度，以期为耐热纤维素酶基因工程菌的规模化生产提供参考。１材料与方法1.1材料1.1.1

菌种

Escherichia coli ECE12，含内切纤维素酶重组质粒PET-30a，由本实验室保藏[8]。1.1.2

试剂

CMC-Na 美国 Sigma公司；蛋白胨、酵母膏和牛肉膏 上海化学试剂公司；玉米芯粉、麸皮和甘蔗渣均在本地市场购买；实 …… 此处隐藏：4057字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……