16S_rDNA鉴定细菌的方法(2)

０％活力。

变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。

复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应

特异性的决定因素。

延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。

2.2.2 材料设备及试剂

设备：eppendorf管、微量取液器、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、PCR仪

试剂：16SrDNA引物、细菌基因组DNA、Taq Plus、dNTP、PCR、冲液、琼脂糖、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA/HindⅢ、染色液、 加样缓冲液

2.2.3 操作步骤

PCR反应

依次混匀下列试剂

5μl 10×PCR反应缓冲液

1μl 4种dNTP

2μl 上游引物（引物１）

2μl 下游引物（引物２）

1μl 模板DNA

0.5μl Taq DNA聚合酶

38.5μl H2O

混匀后离心5秒。

扩增：用94℃变性3分钟， 94℃变性1分钟，61℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟, 循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸5-10分钟，使反应产物扩增充分。 电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物电泳结果。

3.用试剂盒做琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收目的片段

用TaKaRa DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物纯化

4. 纯化后的目的片断送到测序公司测序

也可以直接将电泳检测后的PCR产物送到测序公司，让公司对产物进行纯化和测序 5 .BLAST比对获取相似片段。

将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上进行blast比对，选择与比对序列相似度高的菌株。

6.构建系统进化树

将选择的序列与测序序列用DNAStar软件的MegAlign构建菌株系统进化树。

如果要测16S rDNA的全序列长度则需要对PCR产物做T-A克隆。

T-A克隆步骤：

鉴定

1.1 T-A克隆需要在PCR产物末端加A尾巴

有些PCR聚合酶可以在产物末端加A尾巴，但并不是所有的聚合酶会加A尾巴，所以在克隆之前最好搞清楚使用的酶到底是否加A，否则克隆出来的白班太少，又要讨论很久。具有3'到5'外切酶活性的高保真酶就不会产生A尾巴。

产物末端加A步骤：

用高保真酶扩增完之后，在反应管中加入0.7-1unit的Tap聚合酶。无需更换buffer

期中的dATP已经够用。

在72孵育8-10min。

立即进行纯化，沉淀、跑胶、或用纯化试剂盒。这一点相当重要，否则高保真聚合酶会

将A尾巴或T载体上的T尾巴切掉。

1.2 将加A尾巴的PCR产物与T载体连接

常用的T载体有Invitrogen的T载体；Promege的pGEM-T和TaKaRa的pMD18-T。

1.3 将载体与目的片断的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中进行液体摇床培养，涂平板进行蓝白斑挑选。

1.4 对挑选的菌落提质粒，电泳检测大小，对正确的阳性克隆的质粒进行酶切目的片断回收。

目前对于T-A克隆技可以通过T-A克隆试剂盒来完成。

细菌16S rDNA鉴定是应注意的问题和常见问题

1 细胞裂解注意事项

1.1材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低

1.2选择适当的裂解处理方式

1.3高温温浴室定时轻柔震荡

2 核酸分离纯化

2.1采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系。

2.2采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。

2.3 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。

2.4针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。

3 核酸沉淀、溶解

3.1当沉淀的时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。

3.2沉淀是加入1/10体积的NaAc(PH5.2,3M)，有利于充分沉淀。

3.3沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等。

3.4晾干DNA，让乙醇充分挥发。

3.5若长期储存建议用TE缓冲液溶解，TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase，TE缓冲液PH8.0可以防止DNA发生酸解。

4 DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应

4.1 DNA中含有蛋白，多糖，多酚类杂质：应重新纯化DNA，去除杂质。

4.2 DNA在溶解前有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：应重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。

4.3 DNA中残留有金属离子：应增加70%乙醇的洗涤次数（2-3次）。

5 DNA提取量少

5.1 实验材料不佳或量少：应尽量选择新鲜的材料。

5.2 破壁或裂解不充分：G+菌裂解前应先用生物酶或机械方式破壁；高温裂解时，时间适当延长

5.3 沉淀不完全：低温沉淀，延长沉淀时间；加辅助物促进沉淀。

5.4 洗涤DNA时丢失：洗涤时最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。

6 DNA降解

6.1 未很好的抑制内源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合剂的含量。

6.2 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

6.3 外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

6.4 反复冻融：将DNA分装，保存于缓冲液中，避免反复冻融。

7 反应体系对PCR扩增的影响

7.1 DNA模板：

纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应

完整性： 模板降解会导致PCR扩增无产物

浓度： 加量过多导致非特异性扩增增加

7.2 引物

特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体

完整性：避免反复冻融

浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少

7.3反应Buffer

pH值,盐离子浓度

稳定剂,增强剂

7.4 Mg 2＋浓度

过高非特异性严重

过低无扩增产物

7.4 dNTP Mixture

浓度适当

避免反复冻融

7.5 ddH2O

pH值适当

避免污染

8 PCR常见问题与分析

8.1 无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因：

1. 模板:含有抑制物，含量低

2. Buffer对样品不合适

3. 引物设计不当或者发生降解

4. 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策：

1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

2. 更换Buffer或调整浓度

3. 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

4. 降低退火温度、延长延伸时间

8.2 非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因：

1. 引物特异性差

2. 模板或引物浓度过高

3. 酶量过多

4. Mg2+浓度偏高

5. 退火温度偏低

6. 循环次数过多

对策：

1. 重新设计引物

2. 适当降低模板或引物浓度

3. 适当减少酶量

4. 降低镁离子浓度

5. 适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6. 减少循环次数