实验一 人类基因组DNA的提取与鉴定_百替生物

实验一 人类基因组DNA的提取与鉴定

实验目的

1、学习人类基因组DNA的提取原理和方法。

2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。

实验原理

哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

一、材料

一份提取总DNA的细胞或组织

1.5ml Eppendorf管、微量移液器与吸头、15ml离心管、三角瓶（500或1000ml）。

二、设备

离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。

三、试剂

1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA

2．0.8%（W/V）标准琼脂糖；

3．0.5×TBE缓冲液

4．其他试剂：TE缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲

液、溴化乙锭（EB）

四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA）

（一）DNA的提取

1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清；重复1次。

2. 沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加350ml STE和150ml 10% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10ml 20mg/ml蛋白酶K，摇匀。37℃温箱过夜或50℃ 3~4小时。

3．加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。

4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。

5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100ml TE中，测OD值。

7. TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

（二）DNA的鉴定及定量

1. 比色法: DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml

双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。

DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

用重蒸水将比色杯冲洗干净，用重蒸水或TE把提取的样品稀释100倍。将紫外分光光度计的波长设为260nm，以重蒸水或TE做为对照，测定OD值。

OD260= ；

DNA的浓度=50 OD260 稀释倍数= 。

将波长换成280nm及230nm，用同一样品再次测定OD值：

OD280= ；OD230= ；

OD260/OD280 = ；OD260/OD230= ；

结论：所提取的DNA 。

2. 电泳鉴定

取样品1μl、电泳缓冲液5μl、6×加样缓冲液1μl（含溴酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘油），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体λDNA作为标准。DNA区带应比较集中，泳动速度与λDNA相同或稍慢，证明分子量均 >50kb。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。如果DNA不成区带，而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间，则说明DNA已经被降解成小分子，不能再用来进行限制性内切酶图谱分析。

五、 注意事项

1. 酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开时，可加入适量STE稀释，然后再用酚抽提。

2. 保温可在45~55℃范围内进行。

3. 真核生物的DNA分子很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此抽提DNA时动作不可过猛；溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗口径滴管， 以防机械力（震动）将DNA分子打得太碎。

4. 沉淀DNA时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。

5. DNA溶于TE溶液时可先浓一点，发现太浓时再加些TE溶液。这样能保证DNA样品不至于太稀而无法使用，一般来讲，DNA浓度为0.4~0.6mg/ml最为理想。

6. 溶于TE溶液中的DNA样品比较稳定，可在4℃冰箱中存放1年而不会降解。

思考题：

1、 我们知道，一条染色体含有一条DNA，基因组中不同的染色体DNA的大小是不同的。按理

来说，所提取的基因组DNA中含有多条大小不一的DNA。但为什么用琼脂糖电泳后仅能见到一条主带呢？

2、 基因组DNA制备过程中提取缓冲液有哪些成分，作用是什么？

3、 基因组DNA制备过程中需注意的事项有哪些？

扩展内容

植物基因组DNA的提取

利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS裂解细胞，使蛋白质变性沉淀，用酚氯仿抽提除去蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。

一、材料

鲜嫩的水稻幼苗或其它禾木科植物。

液氮，陶瓷研钵，50ml离心管或1.5ml离心管，枪头，药勺。

二、设备

冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，移液器，电泳设备等。

三、试剂

1．提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0；5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS，1mol/Lβ-巯

基乙醇。

2．RNase A母液。

3．5mol/L KAc

4．其它试剂：酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，氯仿，异丙醇，TE缓冲液，70%乙醇，灭菌双蒸水ddH2O。

四、操作步骤：

（一）植物组织裂解液抽提

1. 取3-5克嫩叶, 剪碎, 研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入50ml（1.5ml）离心管中，加入20ml (1ml) 提

取缓冲液, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟 (时间长，DNA产量高), 不时摇动。

2. 加入5ml (150ul)5mol/L KAc, 颠倒混匀冰浴静置20分钟。

3. 室温下5000rpm离心20分钟。

（二）植物基因组DNA纯化

1. 取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(在通风情况下操作)。待分层后，

12000rpm离心 5分钟。

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