生物化学综合实验报告(2)

将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 （22）1%琼脂糖 2.实验器材

离心机；752紫外分光光度计，研钵，三角瓶，烧杯，玻璃棒，匀浆器，离心管，恒温水浴箱（60度，100度），量筒，吸量管，真空干燥器，紫外分光光度计，石英比色皿，电泳仪，电泳槽，微量移液器，紫外检测灯，移液管（1、2、5ml）,试管及试管架，凝胶塑料托盘，大小烧杯，一次性塑料手套，紫外反射投射仪，洗瓶，胶头滴管，卡尺。

操作步骤：

1.植物组织中DNA的提取及纯度鉴定（小白菜）

（1）从冰箱取出冷冻30min以上的小白菜幼嫩组织剪碎，放入研钵中并加入12ml研

磨缓冲液研磨成匀浆。

（2）将匀浆倒入三角瓶内，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分震荡半分钟，以

脱组织蛋白，然后离心（10000r/min）5min，小心地吸出上层清液备用，弃去中下层含有细胞碎片，变性蛋白质，氯仿等残物。该过程循环2~3次

（3）将收集的上层溶液倒入三角瓶中，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分震

荡半分钟，以脱组织蛋白，然后离心（10000r/min）5min，用吸管吸出上层核酸水同液，移于烧杯中。

（4）用吸管沿烧杯壁缓缓加入2倍体积预冷95%的乙醇，然后用玻璃棒轻轻搅动，将出现的纤维沉淀缠绕在玻璃棒上。

（5）将上述沉淀溶解在PH=8.0, 2ml的TE溶液中，搅拌到完全溶解后，加入RNase溶液，使其最终浓度为50-75ug/mL,在37度下保温30min，以除去RNA，然后加入等体积氯仿-异戊醇混合液，在三角瓶中，震荡半分钟，离心（10000r/min）5min。收集上层水溶液，再次除去残留的蛋白质和所加的RNase.

(6) 按照4的程序加乙醇后，将DNA沉淀挑出(若是无法挑出DNA沉淀，则离心5min （10000r/min），弃去上清液，底部为DNA沉淀)，再将DNA溶解于PH=8.0的2ml的TE溶液中，即得到纯化的DNA溶液。

（7）DNA纯度测定。采用DNA紫外吸收特性进行测定，取少量样品，加PH=8.0的TE

溶液稀释至一定浓度，测A260和A280的值，如A260/A280=1.8，蛋白质含量不超过1.3%，DNA纯度合乎质量标准。

NDA浓度（ug/mL）=×稀释倍数 （L为比色杯厚度，一般为1cm; 0.020为每mL溶液中含1ugDNA钠盐时的吸光值；A260为260nm波长处光吸收值）

2. 肝脏中DNA的提取及纯度鉴定

（1） 取新鲜肝脏（约10g）,用0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液洗去

血液，剪碎，加入10mL 0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液,置匀浆器中研磨，待研成糊状后，浆糊状物离心5min（10000r/min）,弃去上清液，沉淀用0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液洗2-3次。 （2） 向上述沉淀物加入0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液，使总体积为

4mL,然后滴加10%SDS溶液0.5mL,边加边搅拌。加毕，置60度水浴保温10min(用细玻璃棒经常搅拌)，等溶液变得粘稠时（可能不明显）取出冷至室温。此步操作系使大分子脱氧核糖核蛋白从细胞核中溶出，核酸与蛋白质分离。 （3） 加入4mol/L氯化钠溶液1.6mL,使氯化钠最终浓度达到1mol/L搅拌10min，加入约

1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇20min，离心5min（10000r/min）.收集上层水相，去掉在氯仿与水相之间的变性蛋白质沉淀；向上层水相徐徐加入1.5-2倍预冷的95%乙醇，DNA沉淀即析出，离心5min（10000r/min）去掉上清，收集沉淀（DNA粗品）。 （4） 将DNA粗品置于2.7mL0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中溶解，再

加入0.3mL1.5mol/L氯化钠-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液,搅匀，加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇10min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相（含NDA钠盐），弃中层变性蛋白；收集上层水相再加入一倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇10min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相，弃中层变性蛋白。反复几次直到中间层蛋白凝胶层消失。向收集的上层水相加入2倍体积预冷的95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心5min（10000r/min），弃去上清液，沉淀为较纯的DNA. （5） 将上述所得沉淀溶于2mLTE缓冲液中，加入RNaseA溶液至终浓度为20mg/L混匀，

在37度水浴中保温30min。 （6） 向经RNaseA 消化后的DNA溶液中加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇5min，

离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相（含DNA），弃中层变性蛋白,重复抽屉2-3次。 （7） 向除尽蛋白质的上清液中徐徐加入2倍体积预冷的95%乙醇，DNA及沉淀析出。离

心5min（10000r/min），弃去上清液，再用预冷的70%乙醇洗一次，室温倒置干燥。 （8） 将上步所得更纯的DNA沉淀溶于2mL 0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中备用（供定性鉴定或定量测定）。 （9） 将DNA样液适当稀释，移入光径为1cm的石英比色皿，并以0.015mol/L氯化钠

-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液作为空白对照。在紫外分光光度计上分别于260nm,280nm和230nm波长处进行测定，计算A260/A280和A260/A230比值的大小来鉴定DNA样品的纯度。

3. 二苯胺法测定核酸的含量 （一）DNA标准曲线的制作

取8支试管，编号，按下表加入试剂

加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D595nm值。）以光密度为纵坐标，DNA含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。 （二）样品的测定

取2支试管，各加0.2ml待测液加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。

DNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数

DNA产率(%)

含量/毫升 总体积新鲜鲜肝(g) 10

6

100

4. DNA的琼脂糖凝胶电泳（实验一，二样品） 一、DNA电泳样品制作

取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，分别加入25μL样品溶液，然后加入5μL 6×电泳缓冲液，混匀，放入冰箱保存。 二、1.0%琼脂糖凝胶板的制备

1. 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5-1mm的间隙，安置好后保持静置状态。

图5-1 凝胶托盘的组装 1. 托盘 2. 挡板 3. 梳子

2. 称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30mlTBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产生泡沫。

3. 待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60℃）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。

4. 待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。

5. 取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。 三、加样

用微量注射器或移液枪样品液，分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5× …… 此处隐藏：2983字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……