克隆基因的检测与鉴定

基因程原工理纲要第一 第二讲讲基 因程工论属实 基概因工的程主技要术第三讲第四讲

因基工的程酶学础基因克基的隆体载与受体第五讲第六讲

目基的因克隆与分的离隆克基因检的测鉴定与第七讲第八讲克隆因基的表达与物产纯基化表达因调控的

六第

讲隆基因克的检测鉴与定载体型表选法择根据入基因插表型的选择D A电泳检N测 核法杂酸交测法 检免疫学化检法 转测筛选法

译

一节第载体表 型择法选、一药性抗标及其插入记失选择法活1. 理：pB原3R22粒上有质个两菌抗抗性素因: Te基t和rAmpr Tet。上有插入位r点amHB I和Sa Il; mpr上有插入位AP点s t。I

pR3B22

2. pR322B菌抗标记选择素(1)四素环： 抑制细生长，菌不但死细菌。杀

(2氨)青苄素抗性基因霉：生 产-内胺酰，使酶氨苄霉素转青为变青霉酮 酸，使碘青-素霉指示(液2I-I-KampiAclilin (蓝灰色)褪色。)(3环丝氨)酸杀死：长生细菌的但不杀，停止死生的细长菌。

3.

选择程：过(1四环素抗性)插入失 活如在Tet果r上插外源入DA,导N致四环 素性基因抗活，失用四环素加环可氨酸平 板丝培基养选重组择隆克。 Ttr失活的e生长菌被四素抑环，制不被丝环氨酸杀死， 留下保；来 etTr失活的菌不抗环素四，能分生长，反而 被环丝氨裂酸杀死。无

丝环氨培酸养基

()2氨青苄霉素性插抗入失活择选过程如果Amp上插r入源DN外，导A致苄氨霉素 抗青基性因失活，用可碘-青素霉示指液择选

二。 、-乳糖半苷酶显反色选择应乳糖 法-Xgl

-半乳a糖酶苷

半糖乳 半糖

+ 乳

+萄葡 糖5-溴--氯靛蓝4 深色蓝1.原 ：理体载有一段 -上乳半苷酶糖因(Lac基Z) 的段 片(基氨),其上端有外源NDA的入位点。 插体菌受 因基中有组突变的 半乳糖-苷酶因( 片基段失)缺 。以可被ITPG导表诱。达 载和体受体基菌组因可以 补互形完整有成功能的- 乳半糖酶苷。

2. 选

择程

过假阳性 如：插果入外源D的NA正好是3倍数的并没且中止密 有码(不；坏破 )肽。

- 乳糖半酶苷X-使gal解分成蓝产色物。

第

节 根据插入二因基的表型选择利插入的外用源基的因达表产物性特进直接选行择 。只在(特定条件)下。、一理原：1 .补弥陷 缺转进来的外源化因产基物够弥补能体菌 株受的突变型缺陷。受 体： hi菌外源s基因 ：hs+ i不在含氨酸组 培养的中基生长

2.

加新增性使状被化的受转体表现出菌源基因的表型外例。:小鼠的二轻叶还原酶(酸DFRH)三对氧甲二 苄嘧啶氨有性抗。三 甲苄氧氨二嘧 培养啶基平板DHRF 接连 载体

化受 转菌体含HDRF克隆才的能长

生第三

节 DA电泳检N法测用利

有插片段的重组载体的分子入量野生型比 体载分子量大。一、直接电泳测检法转化后从菌的克体隆 中离分质，电粒泳比较 其分、量子。

分量子 arkerM

重 组克 隆载体

二酶切电泳、选筛法. 原1: 根据理已的知源外DN序A的列制限酶性切谱， 选图择一种内切两切酶割粒，质泳电比后电泳 结果较DNA(带数和长)度。 用或适的合切内酶切下入片插断，用其再它 切这个酶片，断泳后比电结果是较否合预符的 结果计。

A

BA或B

不同

隆的克切酶结果

筛过程选A A TT表型选筛加酶切选

T筛A A

T