血清白蛋白的分离纯化及鉴定

血清白蛋白

第33卷第5期

福州大学学报(自然科学版)Vol.33No.5文章编号:1000-2243(2005)05-0691-04

血清白蛋白的分离纯化及鉴定

张少权,李昊,郭春腾,饶平凡

(福州大学生物工程研究所,福建福州　350002)

摘要:由新鲜驴血浆离心得到的血清经冷冻,离心,透析,0.22μm滤膜过滤,经过两步Source15Q离子交换

色谱于HPLC进行纯化,得到3个含有驴血清白蛋白的峰.经SDS-PAGE电泳测定,其分子量在66.0kDa左

右,纯度达到电泳纯.经PAGE电泳鉴定,均为单一驴血清白蛋白.此法步骤简单,用血量少,适用于实验

室常规分析和研究.

关键词:驴;血清白蛋白;阴离子交换色谱;HPLC

中图分类号:Q512文献标识码:A

Isolation,purificationandidentificationofdonkeyserumZHANGShao-quan,LIHao,GUO-,(InstituteofBiotechnology,Fuzhou,,,China)

Abstract:Donkeyserumalbuminfromoffreezing,centrifugation,di2

andpurifiedthroughtwostepsofanion-ex2alysisandfiltrationby0.22changeLCandthreepeaksofalbuminwereobtainedfinally.The

molecularbyS-PAGEwasabout66.0kDa.Itshomogeneitywasalsoverifiedby

PAGE.methodwhichjustrequiresasmallquantityofdonkeybloodisapplicableforgeneral

analysisandresearchinlaboratory.

Keywords:donkey;serumalbumin;anionexchangechromatography;HPLC

阿胶与人参、鹿茸并称“中药三宝”,药用历史已有2000多年.驴皮是制作阿胶的主要原料,提取驴皮中的总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析发现,除了胶原蛋白外,驴血清白蛋白的含量也较高,推测该蛋白可能和阿胶的药理作用有关,因此对其进行分离纯化等相关研究就成为很有意义的一个课题.从方便性和实用性的角度考虑,选择了驴血浆作为分离纯化的原材料.

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,约占总量的60%.它是一种水溶性很强的蛋白,结构稳定,能结合多种小分子,如脂肪酸,胆红素,血红素等,起维持血液的正常渗透压作用.此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用,在医学临床及生物领域

[1,2]有着广泛的应用.考虑到血清白蛋白的经济价值和临床应用等,其分离纯化的方法被广泛的报道.

早期的方法如,Denis的氯化纳法(1847年),Hofmeister的硫酸钠法(1890年)和Hermmarsten的硫酸铵分级盐析结晶法(1894年).从血浆中分离白蛋白的经典方法是Cohn的低温乙醇法(1940年).1980年Curling又提出了色谱法[3].

相对于大量的牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白(HSA)研究文献,驴血清白蛋白的分离纯化尚未见报道.

1　材料与方法

收稿日期:2005-01-10

作者简介:张少权(1981-),男,硕士;通讯联系人:饶平凡,教授.

血清白蛋白

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1.1　材料和试剂福州大学学报(自然科学版)第33卷

TRIzol试剂盒(Invitrogen公司).驴购自河北衡水市,屠宰后取新鲜驴血.Source15Q强阴离子交换树脂(AmershamBiosciences),次高分子量标准蛋白和低分子量标准蛋白(均为中科院上海生物化学研究所监制),其余试剂均为分析纯.

1.2　仪器

高效液相色谱仪(126-solventmodule及166-detector,美国Beckman公司);电泳仪(Mini-proteinIIcell,离心机(ModelAvantiTMJ-251,美国Beckman公司).

1.3　方法

1.3.1　驴皮中总蛋白的提取和分析

新鲜驴皮洗净去毛,切成小块(4mm×4mm)以丙酮(1∶2,VΠV)脱脂,而后采用TRIzol试剂盒提取驴皮中的总蛋白.采用SDS-PAGE电泳分析总蛋白组成,分离胶与浓缩胶浓度分别为7.5%和4%,电压时间为1.5h,考马斯亮兰—R250染色.次高分子量标准蛋白分别为兔肌球蛋白(200.0kDa),钙调蛋白(130.0kDa),兔磷酸化酶B(97.4kDa),牛血清白蛋白(66.2kDa),兔肌动蛋白(43.0kDa).

1.3.2　血浆预处理

屠宰后采集新鲜驴血,加0.38%柠檬酸钠抗凝,2500rΠ10,-20℃冷冻,备用.冷冻处理可以破坏血清里的脂质,,化.取冷冻的血清,充分融化后,10000rΠm离心,的Tris-HCl缓冲溶液(pH=

6.5)于4℃透析过夜,1.3.3　02-HCl缓冲液(pH=6.5)按1∶4的体积比混合,经0.22μm无菌,MTris-HCl(pH=6.5)平衡好的Source-15Q柱(6mm×150mm)进行HPLC分离,280nm波长处检测,用0～0.4MNaCl进行线性梯度洗脱,流速为1mLΠmin.收集目标峰经浓缩透析后上样于以0.02MTris-HCl(pH=7.5)平衡好的Source15Q柱(6mm×150mm)进行二次HPLC纯化,检测波长仍为280nm,未吸附组分流出后用0～0.3MNaCl进行线性梯度洗脱.

1.3.4　纯度鉴定

[4]1)SDS—PAGE.按照LaemmLi体系,分离胶与浓缩胶浓度分别为12.5%和4%,电压为120V,

时间为1.5h,考马斯亮兰—R250染色.低分子量标准蛋白(中科院上海生物化学研究所)为兔磷酸化酶B(97.4kDa),牛血清白蛋白(66.2kDa),兔肌动蛋白(43.0kDa),牛碳酸酐酶(31.0kDa),胰蛋白酶抑制剂(20.1kDa),鸡蛋清溶菌酶(14.4kDa).

2)PAGE.分离胶为10%聚丙烯酰胺,Tris-HCl缓冲液(pH8.8);浓缩胶浓度为4%,Tris-HCl缓冲液(pH6.7);上下槽缓冲液为Tris-甘氨酸(pH8.3),样品缓冲液含甘油20%,溴酚兰0.05%;取样品缓冲液10μL,样品10μL,混匀,加入电泳槽的样品孔中,起始电压为80V,样品从浓缩胶进入分离胶后,电压改为120V.至溴酚蓝指示剂迁移至距凝胶底部前沿时,停止电泳.

2　结果和讨论

2.1　驴皮总蛋白的分析

利用TRIzol试剂盒提取驴皮中的总蛋白,经SDS-PAGE电泳(图1)发现,130.0和66.2kDa附近的蛋白含量最多.从驴皮的结构分析,位于真皮浅部,与表皮直接接触的部分为“乳头层”,上面布满小动脉、静脉与毛细血管,驴血可通过小动脉进入毛细血管.而血清白蛋白又是血浆中含量最多的蛋白,因此推测分子量在66.2kDa的该组分为驴血清白蛋白.

2.2　Source15Q离子交换色谱

Source15Q强阴离子交换材料是高效液相色谱的理想介质,操作压力范围广,蛋白吸附量大,可达

血清白蛋白

第5期张少权,等:血清白蛋白的分离纯化及鉴定 693 25mgΠmL.预处理过的驴血清经source15Q离子

交换色谱柱于HPLC分离(图2(a)),其中P1,

P2,P33个峰的样品经SDS-PAGE鉴定,主要蛋

白分子量均在66.2kDa附近,根据血清白蛋白是

血清中含量最多的组分和分子量判断,为驴血清

白蛋白.P1,P2,P33个组分经浓缩透析后分别

进行source15Q二次HPLC色谱分离,去掉未吸

收组分,采用0～0.3MNaCl线形梯度洗脱,得到

得到图2中的(b)、(c)、(d)三图中A1、A2、A3

3个峰,收集相应样品经浓缩冻干后,进行电泳图1　驴皮中总蛋白的SDS-PAGE电泳图

Fig.1　SDS-PAGEoftotalproteinofdonkeyskin鉴定.

实验表明该离子交换色谱图上驴血清白蛋白组分的峰形较宽并分叉(图2(a)).图2(b)～(d)显示,出峰时间不同的P1,P2,P3样品经过重复色谱分析,出峰时间基本都在60min左右.由于血清白蛋白可以结合和运输多种不同的分子,如胆红素,脂肪酸,无机物等,[5,6].此外这些小分子本身可能带有的电荷会影响离子交换色谱的分离.白蛋白结合是造成这种色谱现象的主要原因

.

图2　驴血清Source15Q阴离子交换色谱

Fig.2　Source15Qanionexchangechromatographyofdonkeyserum

2.3　纯度鉴定和相对分子质量测定

A1,A2,A3组分经SDS-PAGE(图3(a))和PAGE(图3(b))电泳检验均为一条带,这表明所分离的驴血清白蛋白组分已达到电泳纯.分子量测定采用SDS …… 此处隐藏：2929字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……