分子生物学 - 图文(9)

通过基因之间的连锁行为确定基因在染色体上的排列。 将重组分数转换为遗传距离；

人类染色体平均遗传长度为3300厘摩。 现代遗传图谱 DNA分子遗传标记

? 第一代DNA 遗传标记——限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）； ? 第二代DNA 遗传标记——小卫星DNA（minisatellite DNA）、微卫星DNA（microsatellite DNA） ； ? 第三代DNA 遗传标记——单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism SNP）；

1、限制性片段长度多态性 （RFLP）

定义 用限制酶消化某个DNA分子后出现的长度多态性，具有种质特异性而常作为遗传学分子标记

原理 DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。 限制性片段长度多态性 （RFLP）

优点 RFLP的出现频率远远超过了经典的蛋白质多态性。而且只要选择得当，生物体内出现共显性RFLP及RAPD分子标记的频率较高。 局限 一般只能产生限制酶切位点的―切开‖和―不切开‖两种情况，所提供的多态性信息量较小。进行RFLP分析时，既不安全又不易自动化。 RFLP基本步骤

DNA提取，用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段

将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上

用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。 2、小卫星DNA

小卫星DNA（minisatellite DNA）是指重复单位长度在15～65个核苷酸左右的串联重复序列，一般长度不超过20kb。 散布于人类各染色体的不同部位，其重复次数（即小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的。

同时又按照孟德尔规律遗传，所以是很好的DNA多态性标记，被广泛应用于基因定位、DNA指纹分析和遗传病的连锁诊断。 微卫星DNA

微卫星DNA（microsatellite DNA）是指重复单位长度在2～6个核苷酸之间的串联重复序列。也称为简短串联重复序列。 通常只重复10～60次。

人类基因组中已定位的微卫星DNA位点超过10 000处，因其重复次数在不同个体间呈高度变异性而被广泛应用于遗传分析和疾病诊断中。 3、单核苷酸多态性（SNP）

?指基因组中核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。 ?包括单碱基转换、颠换、插入/缺失等。

?SNP位点极其丰富，在人的基因组中，每1000bp就会有1个SNP。

二、 物理图谱 (physical map)

?定义 以一段已知核苷酸序列的DNA片段（序列标记位点sequence tagged site，STS）为路标，以Mb或kb为图距的基因组图。 ?STS其实只是基因组中任何单拷贝的短DNA序列，长度在100～500bp之间。 ?物理图谱是用物理学方法定位的由客观物组成的图谱。

?物理图的主要内容是建立相互重叠连接的―相连DNA片段群‖。

物理图谱是遗传图谱过渡到表达图谱的桥梁，物理图谱的最终形式就是碱基在染色体上的相对顺序。 构建物理图的方法之一（末端标记法）

?待测DNA片段的5‘或3‘端先用P标记； ?用某限制性内切酶部分酶解；

?电泳和放射自显影分析这一组酶解片段的长度。

?各相邻片段的长度之差就是二个相邻切点之间的距离，也即它们之间片段的大小。

?如果有足够数量的限制性内切酶分别进行分析，就可以对这一DNA片段作出比较详细的物理图谱。

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三、 基因图谱

即基因转录图（cDNA图），或者基因的cDNA片段图，也就是表达序列标签图。

?EST（expressed sequence tag）通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5?或3‘端序列称为表达序列标签，一般长

300-500bp左右。

?目标：鉴别全部基因，包括RNA基因，以及基因组中其它序列的结构和功能。

1、 人类基因组计划研究内容 寻找基因

获取基因的全长cDNA序列 确定DNA顺序中基因的位置 研究基因的功能 基因表达 蛋白质组学

人类基因组计划研究主要分为两个部分

?转录图或基因表达谱研究所提供的信息，使人们有可能系统、全面地从mRNA水平了解特定细胞

?一是人类基因组DNA的完全测序；

?二是基因DNA序列的识别和正常功能，基因变异与人类疾病的研究；

2、 人类基因组计划策略

基本策略：建立基因组DNA的重叠细胞克隆群；次级克隆群；测序；分析

?国际人类基因组测序策略“ 逐个克隆法 ” ?Celera Genomics 人类基因组测序策略

“ 全基因组鸟枪法 ”：

国际人类基因组测序策略“ 逐个克隆法 ” 构建BAC克隆 ↓

限制性酶处理获得指纹 ↓

根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 ↓

根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 ↓

每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序,组装 ↓

将BAC插入顺序与BAC克隆指纹重叠群对比,将已阅读的顺序锚定到物理图上 全基因组鸟枪法

基本原理 对某基因组文库全部克隆片段进行末端序列测序中未测到的碱基数，即缺口（gap），与已测定的总碱基数相关。随着已测定碱基数的增加，缺口的总碱基数目会迅速减小。 要点

?要建立大量的、高度随机、插入片段大小为1～2kb的基因组文库。 ?高效、大规模的末端测序。

?序列集合。以最大限度地排除错误的连锁匹配。 ?填补缺口

3.5.4 后基因组研究计划

“功能基因组学”是研究基因组中所有基因功能的学科。它在整体水平上研究一种组织或细胞在同一时间或同一条件下所表达的基因的种类、数量、功能及在基因组中的定位，或同一细胞在不同状态下基因表达的差异。 主要内容

?基因表达谱的研究 ?蛋白质产物的功能 ?基因组多样性的研究 ?基因组功能注释

第一节 转座子

转座现象 或称移位（transposition），是由可移动因子介导的遗传物质重排现象。

转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA）。转座的发生不依赖于转座子和靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个部位直接转移到另一个部位。

转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的， 1.1 转座子

转座子（transposon，Tn）

?基因组中存在的能自主复制和位移的一些DNA序列。

转座子的共同特点

? 两端有反向重复序列（inverted terminal repeats ，ITR ，IR ）； ? 转座后靶位点重复序列是正向重复（direct repeats ，DR ）； ? 编码与转座有关的蛋白，例如转座酶； ? 可以在基因组中移动；

1.2.1 插入序列

简单型转座子 不含任何宿主基因，常被称为插入序列（insertional sequence）即IS序列，是可独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。 IS1

IS1含有转座酶基因，负责IS1的移动，该基因的两端为24 bp的反向重复序列

IS1 IR 转座酶基因 720bp IR 24bp 24bp 插入序列IS 1的结构

1.2.2 复合型转座子

带有某些宿主基因（如抗药性基因），其两翼往往是两个相同或高度同源的IS 序列。 两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性。

Tn1681 IR IS1 IR 大肠杆菌热稳 定毒素I基因 552bp 复合转座子的结构