分子生物学 - 图文(7)

? 正选择标记基因：赋予细胞新的表型，以利于筛选；如新霉素磷酸转移酶基因（neo ）

? 负选择标记基因：在一定条件下使发生随机整合的细胞死亡；而发生同源重组的细胞因选择标记基因失活而得以存活。如TK 激酶基因、HGPRT

基因

置换型载体与插入型载体

利用同源重组构建基因敲除小鼠的步骤 ES细胞的获得

?常用鼠的种系是129及其杂合体，是基因敲除的理想实验动物。 ?雄性ES细胞较雌性ES细胞稳定，且容易产生生殖系嵌合体。

同源重组

?将重组载体导入（显微注射或电穿孔法）同源的胚胎干细胞，使外源基因与ES细胞基因组中的相应部分发生同源重组。将重组载体中的DNA

序列整合到内源基因组中，从而得以表达。 利用同源重组构建基因敲除小鼠的步骤 选择筛选已击中的细胞

动物细胞同源重组的概率为10-2～10-5 ，动物细胞同源重组的概率为10-4～10-5

正负筛选法（PNS法）：正选择标记基因位于同源序列内，负筛选标记基因位于同源序列外侧； 正向筛选法：正选择标记基因缺失自身某个调控序列； 利用同源重组构建基因敲除小鼠的步骤 表型研究

观察嵌合体小鼠的性状，比较基因改变前后表型的变化。 PCR或Southern杂交鉴定 得到纯合体 生殖嵌合体

基因敲除技术的应用与前景 建立生物模型

?可用于建立某种特定的基因缺失的生物模型。可以是细胞，也可以是完整的生物个体。

疾病的分子机理研究和基因治疗

? 可以确定特定基因的性质，以及它对机体的影响，从而发现致病基因后寻找治疗的靶基因。

提供廉价的异种移植器官 免疫学的应用：异源抗体

改造生物，培育新的生物品种：定向改造生物 基因敲除技术的缺陷

基因敲除技术存在一个难以克服的缺陷，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能

? 有许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个冗余的基因，并不能造成可识别的表型变化，因为基因家族的其它成员可以提供同样的功能。 ? 某些必需基因的敲除是致死性的，同样也无法获知该基因的功能。

蛋白质工程的一般步骤 分离纯化目的蛋白；

目的蛋白的分析，以获得其结构和功能的数据；

通过蛋白质序列设计寡核苷酸引物或探针，从cDNA文库或基因文库中筛选出相关基因序列； 设计改造方案；对基因序列进行改造；

将改造的基因片段插入适当的表达载体，并表达产物； 分离纯化表达产物，并对其进行功能检测。 蛋白质组和蛋白质组学

?蛋白质组（proteome）

?指对在一定时间内或某一特定的环境条件下，细胞、组织或有机体所表达的所有蛋白质的总和。 ?蛋白质组学（proteomics）

? 对蛋白质组进行系统的、总的研究的一门学科。

?意义：蛋白质不是单独起作用，而是以分子间的相互作用来执行功能； ? 一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物； ? 蛋白质的表现是多样的，动态的；

蛋白质相互作用

机体细胞内每个蛋白质并不是独立发挥作用，通常与其他蛋白质相互作用形成较大复合体，在特定的时间和空间内行使特定的功能，构成各项生命

活动的基础 。

作为一种好的蛋白质相互作用方法，应该具备两个条件 : ( 1 )特异性 ,能鉴定出与目的蛋白特异作用的蛋白 ( 2 ) 能反映在生理状态下蛋白质的相互作用 结构域（domain）

定义：蛋白质三级结构中，折叠紧密的球状或纤维状区域，具有特定功能，这样的区域称为结构域。

结构域是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，一条多肽链在这个域范围内来回折叠，但相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。 基序（motif）

在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，即基序。 基序（或模体）是结构域的亚单位，通常由2～3二级结构单位组成，一般为α螺旋、β折叠和环（loop）。 一个基序具有特征的氨基酸序列，基序的空间构象是其特殊功能的结构基础。 1、随机多肽文库 定义：

?人工合成随机肽段（6～9肽）的编码DNA片段，并将其插入丝状噬菌体的外膜蛋白基因中，使其展示在噬菌体表面；每一个噬菌体表面展示

一种多肽序列，它们的集合体即构建成一类多肽文库。 应用

? 根据生物大分子之间特异的相互作用（例如抗原- 抗体、配体- 受体、酶- 底物间的特异性结合反应），从文库中筛选出能模拟某些生物大分子

功能的短肽小分子。 1、随机多肽文库 基本原理

?含有关键氨基酸残基的短肽能模拟蛋白质分子中的功能；

?蛋白质分子间的相互作用或识别是通过局部肽段间的相互作用来实现的；

特点

? 模拟肽是基于肽与酶、肽与抗原/ 抗体、肽与受体/ 配体之间实际结合的亲和力 而筛选出来的，而不是从纯理论推导出来的，因而更符合生物

体内的情况。 1、随机多肽文库 意义

? 模拟肽是用人工选择的方法替代长期自然选择进化过程，快速实现功能肽的开发；

? 有了多肽文库，就有可能用所需的蛋白直接从中筛选出能与其特异结合的模拟小分子，经噬菌体大量增殖后，再分离纯化该肽段；还可以直接

利用多肽合成仪，批量固相合成这些小肽。 2、噬菌体展示技术 定义

?将与靶蛋白相关的特定基因随机水解，所得DNA片段（100～300bp）插入丝状噬菌体的外膜蛋白基因中，使其展示在噬菌体表面；每一个噬菌

体表面展示一种随机多肽序列，它们的集合体即构建成一种文库。 特点

? 减小文库的复杂性；提高文库的筛选效率；简化与载体连接的过程。

3、酵母双杂交系统

?原理：

?将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编

码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。 酵母双杂交系统的应用 分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析 分析未知蛋白相互作用 绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用 4、串联亲和纯化(TAP)技术

?利用一种经过特殊设计的蛋白标签，经过两步连续的亲和纯化获得更接近自然状态的特定蛋白复合物的技术，在一定程度上打破了制约蛋白质

组研究的瓶颈。目前该技术已在酵母蛋白质组研究中应用。

TAP技术在低浓度情况下也能高效富集目的蛋白质，并且纯化多在天然条件下进行，故可较好的保持靶蛋白复合物的空间结构，得到的产物可用于活性检测及结构分析。 4、串联亲和纯化(TAP)技术

既可用于分析在稳定复合物中的蛋白质间相互作用，也可分析反应中蛋白质间的瞬时相互作用，鉴定与靶蛋白发生直接或间接相互作用的配体(核酸、脂类及多肽)，这都是传统双杂交技术所不可比拟的。与质谱连用的TAP技术将在解析生物蛋白复合体的功能方面发挥重要作用。 TAP技术原理

选用了两个连续的标签而不是通常意义上的一个。

?标签共分三部分：蛋白A 、C B P (calmodulin binding peptide，钙调素结合多肽)和中间连接的TEV 酶识别的酶切位点。

而使 …… 此处隐藏：1646字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……