分子生物学 - 图文(8)

5、荧光共振能量转移

（fluorescence resonance energy transfer，FRET）

?荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，

通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。

? FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。

FRET技术原理

FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，

?使供体荧光强度降低，

?而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。

?能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。

FRET技术的应用—— 活细胞内检测蛋白激酶活性

?利用FRET原理设计了一种新的探针（一种融合蛋白）：新探针包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域，一个与磷酸化底物结构域相结合

的磷酸化识别结构域。

?这个探针蛋白的两端是GFP的衍生物CFP与YFP，利用FRET原理工作。当底物结构域被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与

其结合而引起的内部折叠，两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移。如果磷酸酶进行作用将其去磷酸化，分子就会发生可逆性的变化。 一、 链终止法测序(the chain termination method) 基本原理:

通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 二、 自动化测序 基本原理

与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基. 三、DNA芯片测序 基本原理

将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. 四、 连续测序法 五、 序列的组装

随机测序也称”鸟枪法”.

序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况.

A 小片段测序 aaa B C 计算机拼装 A 指导测序与序列组装

在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，其基本步骤如下: A 构建平均为2Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序;

B C B 构建平均10Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序,读取2个端部顺序;

C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行序列组装，排成重叠克隆群\\

A 大片段contig 小片段测序拼装 B C A .

两种策略的比较

鸟枪法策略 指导测序策略 不需背景信息 构建克隆群 (遗传、物理图谱) 时间短 需要几年的时间 需要大型计算机

得到的是草图(Draft) 得到精细图谱 六、基因文库

B C 基因文库(G-文库)：是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。 基因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列。

每一个克隆只含有一个基因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。 cDNA文库

cDNA文库(C-文库) ：是以mRNA互补合成的cDNA的随机片段的重组DNA克隆群。 cDNA文库不含内含子序列，易于表达。

具有组织细胞特异性：不同组织细胞、不同发育阶段，基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态； C-文库比G-文库小得多，更容易筛选。

cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 mRNA 反转录酶 cDNA 复制 A A T 碱水解 双链cDNA 载体 重组DNA分子 T DNA聚合酶受体菌 cDNA文库 SI核酸酶

基因组研究的重要任务

?构建基因组的遗传图谱 ?构建基因组的物理图谱

?测定基因组DNA的全部序列； ?构建基因组的转录图谱； ?分析基因组的功能。

一、 遗传图谱

遗传图谱（genetic map） 即连锁图谱，以具有遗传多态性的遗传标记为―路标‖，以遗传学距离为图距的基因组图。 经典遗传标记 DNA分子遗传标记 经典遗传图谱 …… 此处隐藏：271字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……