蛋白质及酶工程试验(7)

A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A （二）部分收集器的操作方法：

1. 将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开\慢\和“定”，再按一下\停\设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。

2. 定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。

六、实验报告

1．如实完整地记录实验流程、现象及结果，计算理论塔板数并对其进行深入分析和讨论。

2．结合理论塔板模型，分析柱效的影响因素，以及如何提高柱效。

七、背景资料

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。

凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。

图1 凝胶层析的原理

（一） 层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用 20 -30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要 100cm 左右长的层析柱，其直径在 1 -5cm 范围内，小于 1cm 产生管壁效应，大于 5cm 则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 (一般制备用凝胶柱，直径大于 2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上 ) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m。 ⑴ 分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 20－30cm ，柱高与直径的比较 5:1─10:1 ，样品溶液体积应小于 凝胶床体积为的 20% 。 ⑵ 分级分离时柱高与直径之线为 20:1─100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000 ），样品溶液体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 ⑶ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体积可达柱床体积的 20 — 25 % ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

（二）凝胶的类型

常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下：