蛋白质及酶工程试验(5)

蛋白质含量（mg/g鲜重）＝

式中 C－查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量（mg）；

V－提取液总量（ml）； a－测定时取样液量（ml）； W－取样量（g）。 【注意事项】

1.Folin试剂乙只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前，还原反应即能发生。 2.为了保证反应进行完全，反应在25～30℃水浴中进行，反应30min后准时比色。

3.还原物质干扰本实验。 【方法评述】

上述两种方法均是灵敏度为微克级的高灵敏度定量测定蛋白质方法，前者稳定，后者简便；二者均优于现有的其它方法。二者的缺点是：Lowry法受植物体内存在的酚类物质干扰；考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低，且不同蛋白质与色素结合状况有差异。 【思考题】

1.测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义和用途？试举二例说明。 2.两种测定方法各有何优缺点？在实验中如何选择合适的方法并排除其缺点？

3.用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的方法中，标准曲线制作与其他实验有何不同？

4.Lowry法测定蛋白质含量的原理是什么?测定中应注意什么问题？

实验六 酵母蔗糖酶的结晶

一、原理

常用的蛋白质结晶方法有：微池法结晶，蒸汽扩散法，液-液扩散法和透析结晶法等。现有的结晶方法结晶量小，需要使用高度纯化的蛋白质，常使用离子交换或亲和层析等方法进行纯化。常用的结晶剂包括盐、有机溶剂、聚乙二醇4000等。与结构研究相比，用作交联酶晶体催化剂的酶晶体对晶体质量要求相对较低，但要求数量大。从纯化程度较低的酶液中结晶酶，其结晶时间可能较短，结晶液可达数升至数百升，所用试剂相对较少，从而大幅度降低酶晶体的成本。硫酸铵．丙酮协同沉淀要优于单独硫酸铵分级沉淀，可能有以下几点：(1)硫酸铵和丙酮分级沉淀的机理不同，前者是中和蛋白质的表面电荷使其沉淀，而后者是降低溶液的介电常数使其沉淀，两者在协同沉淀时使其作用互补，使效率更高。(2)当单独使用硫酸铵沉淀时，随着其饱和度的升高，溶液的密度也变大，不利于离心分离，而加入一定体积丙酮后，溶液的密度减少，有利于离心分离。(3)与单独硫酸铵、丙酮沉淀相比，它的第一次沉淀量大，除杂多，纯化效果好。

二、实验材料、仪器和试剂

1、实验材料 实验三纯化得到的酵母蔗糖酶 2、仪器

（1）高速冷冻离心机 （2）真空干燥器 3、试剂

（1）硫酸铵（2）丙酮 三、操作步骤

1、丙酮一硫酸铵协同除杂

首先向原酶液中加硫酸铵至45％饱和度，冰浴，搅拌，5min加完。然后加入0.3倍酶原液体积的丙酮，5min加完。此时溶液会分相，用低速大容量多管离心机离心除去沉淀，保留上清液。此步操作为丙酮一硫酸铵协同除杂。 2、浓缩

向上清液中快速加入硫酸铵至75％饱和度，5min加完。由于丙酮和硫酸铵的协同作用，静置15～30min后溶液分相，上相约占总体积的1／3，为丙酮及过氧化物酶的混合物；下相几乎无活性，可直接弃去。 3、结晶

将上相离心，取相界面处沉淀，即为浓缩过氧化物酶。将沉淀抽真空除去丙酮后，在显微镜下观察。用测微尺测量晶体尺寸。

四、结果分析

将得到的酵母蔗糖酶的晶体显微镜下观察形态并描述，用测微尺测量晶体尺寸并记录。

实验七 酵母蔗糖酶的化学修饰

一、 原理

蛋白质的化学修饰是研究蛋白质结构与功能的重要方法，对蛋白质侧链基团进行化学修饰，不仅可以探明酶活性部位的结构，也可为改进酶的原有性质(如稳定性等)提供理论基础。其中苯甲基磺酰氟可以特异性修饰丝氨酸残基、三硝基苯磺酸可以特异性修饰赖氨酸残基、对氯汞苯甲酸可以特异性修饰巯基、IAc可以特异性修饰组氨酸残基、N一溴代琥珀酰亚胺可以特异性修饰色氨酸残基、二硫苏糖醇可以特异性修饰二硫键、EDTA 是金属离子的螯合剂，可与酶活性中心的金属离子发生作用 二、 仪器和试剂 2、试剂

（1）苯甲基磺酰氟(PMSF) （2）三硝基苯磺酸(TNBS) （3）对氯汞苯甲酸(PCMB) （4）IAc

（5）N一溴代琥珀酰亚胺(NBS) （6）二硫苏糖醇(DTT) （7）EDTA

（8）0.2 mol/L乙酸缓冲液（pH4.6） （9）0.5 mol/L蔗糖溶液

（10）砷钼酸试剂：将50g钼酸铵溶于900mL水，边搅拌边加入42mL浓硫酸；另取6g砷酸钠溶于50mL水，加入到前一溶液中，彻底摇匀，定容至1000mL，于37℃下保温24h，然后在室温下储存于棕色瓶中。 （11）Nelson试剂：

A液：取25g无水碳酸钠、25g酒石酸钾钠，加水溶解后再加入20g碳酸氢钠、200g无水硫酸钠，加水定容至1000mL。

B液：将15gCuSO4·5H2O溶于90mL水，滴加2滴浓硫酸，定容至100mL。

将A液与B液按50：2的比例（体积比）进行混合，即为Nelson试剂，用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。 三、 操作步骤

1、将浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的各种修饰剂0.5 mL与酶液0.5 mL在37 ℃下作用20 min，测定其剩余活力，以pH4.6的乙酸缓冲液代替抑制剂溶液测得的活力为100%。

2、以蔗糖为底物，采用Nelson's法测定蔗糖酶的活力。 Nelson's法步骤：

1、仪器 （1）恒温水浴锅 （2）电炉 （3）722分光光度计

1、加入0.2mol/L 乙酸缓冲液0.2mL、0.5mol/L 蔗糖溶液0.1 mL、水0.6mL、酶液0.1mL保温20min。

2、然后加入Nelson试剂1mL置沸水浴20min。

3、然后加入砷钼酸试剂1mL保温5min后，加入7mL水混匀，A510 nm处比色。

四、结果分析

以抑制剂的浓度为横坐标，以相对酶活为纵坐标，绘出各种抑制剂的酶活曲线图。

实验八 酶法澄清苹果汁加工工艺优化

一、实验原理与目的

苹果汁中存在的果胶，有很强的保护胶体的作用，能保持稳定的混浊度。同时，果胶溶液黏度大，如果不加处理，过滤是困难的，而且即使过滤之后，在果汁中所存在的果胶和其它高分子物质，在贮藏中，由于分解、与金属离子结合及其他作用，也会产生凝固沉淀。因此，在过滤之前，必须先进行澄清。常用的澄清方法主要有自然澄清法和热处理法、冷冻法、酶法、加澄清剂法、离心分离法、超滤法等。酶法同其他方法比较,具有用量少、作用时间短、澄清效果好等诸多特点,且酶法的作用机制是生物降解。

本实验利用果胶酶对苹果汁进行澄清,通过优化酶法澄清苹果汁的工艺参数，使学生理解饮料加工工艺中酶法澄清的原理和操作方法。

二、实验材料与设备 1. 实验材料

新鲜苹果、果胶酶、抗坏血酸溶液。 2. 实验设备

秤、榨汁机、循环水真空泵、可见分光光度计、色差计、水浴锅、压榨机或离心分离机。

三、实验内容 1．工艺流程

原料选择→清洗→破碎→榨汁( 加抗坏血酸护色)→过滤→原汁→加入果胶

酶澄清→灭酶→过滤→清汁。 2．操作要点 （1）苹果汁制备

取新鲜苹果清洗后，去皮，去核或不去皮，不去核,后切分成长约2cm的小块, 放入榨汁机。在榨汁时放入苹果质量0.1%的抗坏血酸溶液护色或不护色, 将榨出的苹果汁用滤布粗滤得原汁，使用压榨机或分离机分离苹果渣中的果汁，与过滤的清汁混合。

（2）果胶酶澄清苹果汁的工艺条件优化

根据果胶酶对果胶等大分子物质的生 …… 此处隐藏：1777字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……