蛋白质及酶工程试验(4)

（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。

表28-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 3.结果计算

样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=

式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（ml）； a－测定所取提取液体积（ml）； W－取样量（g）。

二、LOWRY法

【原理】

Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。 Lowry法 的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被 酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。 【仪器与用具】

试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。 【试剂】

Na2WO4·2H2O；Na2MoO4·2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；

牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。 【方法】 1.酚试剂的制备

（1）取Na2WO4·2H2O 100g，Na2MoO4·2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。安上回流冷却装置（使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。冷却后加入Li2SO4·H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。

使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度，用时适量稀释，使最后浓度为1mol/L H＋，此为Folin-酚试剂乙液。

（2）首先配制①4% Na2CO3溶液；②0.2mol/L NaOH溶液；③1% CuSO4溶液；④2%酒后石酸钾钠溶液；使用前①与②等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液；将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按50︰1混合；配成Folin-酚试剂甲液。此试剂只能用一天。 2.标准曲线的绘制

（1）取7只试管编号,分别加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml标准蛋白质溶液，用水补到1ml，便成为每管含蛋白为0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg标准系列（必要时可做重复）。 （2）加5ml试剂甲，混匀，于30℃放置10min。

（3）喷射加入0.5ml试剂乙，立即振荡混匀，在30℃下保温30min。 （4）准确到30分后，以不加标准蛋白的管为空白，在500nm波长下比色测定吸光度值。

（5）以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 3.样品测定

（1）取50μl样液加入试管中，（样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例，提取方法见各酶活测定）加蒸馏水补至1ml，然后重复步骤2的（2），（3），（4），以空白为参比，测吸光度值。

（2）根据吸光度值，查标准曲线求得蛋白质含量。 4.结果计算