蛋白质及酶工程试验

实验目录 实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

实验二 β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化 实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定 实验四 酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究 实验五 植物体内可溶性蛋白质含量的测定 实验六 酵母蔗糖酶的结晶 实验七 酵母蔗糖酶的化学修饰 实验八 酶法澄清苹果汁加工工艺优化 实验九 原果胶酶的提取与活性测定 实验十 层析柱装填及柱效测定

实验十一温度对酶活力的影响－－最适温度的测定

实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

一、原理

通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。固定化酶的特性主要表现在：①稳定，不易破损，可以反复使用多次；②酶不与产品混合，制品较易纯化；③有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。(化学式见课件)

二、实验材料、仪器和试剂

CHO—(CH2)3—CHO

1、材料 ????

尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm

2、仪器

(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱 3、试剂

(1)18.6êCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液 (4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)

(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5

(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液

(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。

(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。 三、操作步骤

1、固定化酶的制备

(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6êCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。

(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至PH值中性。 (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。

(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.5～1mg/mL)在4℃下固定3.5h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL)。

(5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

2、酶活力测定

(1)溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37℃下预热

10min，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。

在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位(U)(以下同)。 (2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。

(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。 四、结果计算

固定化酶总活力

活力回收= ---------------×100%

溶液酶总活力 固定化酶总活力数

相对活力= ----------------------- ×100% 溶液酶总活力数-残留酶活力数 五、注意事项

(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。

(2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。

(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。

实验二 β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化

采用物理或化学的方法固定化微生物细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。对于固定化细胞，以微生物细胞在固定化后的生长状态可分为：固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞三类。固定化死细胞是在固定化前或固定化后对微生物细胞进行加热、冷冻、干燥、表面活性剂、化学试剂等处理，使细胞处于死亡状态；固定化活细胞是在固定化后细胞仍存活但并不增殖；固定化增殖细胞是固定化后细胞不仅存活，而且在使用过程中还能增殖。这三类固定化细胞中最令人感兴趣的是固定化增殖细胞。因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。

完整细胞的固定化对于细胞内酶的利用有明显的优点，它保持了酶在细胞内环境中的稳定性，成本低，可以利用细胞内的复合酶系进行反应。当反应需要辅助因子时，固定化细胞的优点更加突出，因为活细胞能再生辅助因子。

微生物细胞的固定化方法与固定化酶的方法类似，有吸附法、包埋法和不用载体法。固定化细胞的活力及其它性质与游离细胞有所不同。细胞经固定化后，一般细胞的稳定性增加。固定化细胞的最适反应温度、最适pH值、最大反应速度大多与游离细胞相同；饱和常数与游离细胞相比有的不变，有的变化很大，这可能是由于载体与底物间静电相互作用以及存在扩散效应的缘故。 一、实验目的

学习细胞固定化的原理，通过用海藻酸钠包埋法固定含β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌，掌握菌体细胞包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。

二、实验原理

固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。 三、实验步骤及方法

1、试剂

（1）芽孢杆菌细胞：将对数生长期的芽孢杆菌离心(3200r/min，20min)，收集

细胞。

（2）海藻酸钠溶液：用蒸馏水配制2％的海藻酸钠溶液，灭菌后备用。 （3）2％氯化钙溶液。

（4）2mmol／L ONPG溶液。

（5）0.1mol／L pH7.O磷酸缓冲液。 （6）lmol／L Na2C03。 2、细胞悬浮液的制备

称取产β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌湿菌体3g，加无菌水6mL，搅拌均匀制成悬浮液。

3、细胞的固定化

（1）取芽孢杆菌菌体悬浮液3mL，悬浮在10mL海藻酸钠溶液中混合均匀。 （2）用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴人到50mL氯化钙溶液中，浸泡30~120min。

（3）滤出凝胶珠用无菌水洗涤，得到固定化细胞，称重。 4、酶活力测定 （1）细胞悬浮液酶活力测定：将菌体悬浮液3mL稀释10－20倍，取试管2支，每管加入2mmol／L底物邻硝基苯β一半乳糖苷(ONPG)溶液1mL，在65℃恒温水浴中预热5min后，每管分别加入上述菌体悬浮稀释液1.0mL，65℃精确反应15min后。每管加入2mL lmol／L Na2CO3溶液终止反应，3200r/min离心5min，取上清液在分光光度计上比色，读取420nm处的吸光度值。取2支测定管的平均

值。空白管以1.0mL 0.1mol／L pH7磷酸缓冲液代替菌体悬浮稀释液，其余操作同上。

（2）固定化菌体细胞的酶活力测定：精确称取固定化菌体细胞60mg于一试管内 …… 此处隐藏：1657字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……