蛋白质及酶工程试验(2)

（2）固定化菌体细胞总酶活力b(相对值)

测定平均值（A420）×固定化菌体总量（mg） b＝------------------------------------------ 60（mg）×15

（3）酶活力回收＝(b／a)×100％ 四、结果与讨论

（1）固定化细胞内酶活力回收值的高低与哪些因素有关?

（2）固定化细胞的活力、底物专一性、反应温度、动力学常数与游离细胞相比有否不同?

（3）比较各种细胞固定化方法的优缺点。

实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定

酶的纯化

一、原理

酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，提取蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。

离子交换层析法(ion-exchange chromatogramphy,简称IEC)中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH值有关，因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力，因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度 (或两者同时改变)来实现。与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。梯度洗脱是在洗脱过程中，使洗脱液的pH值(或两者同时)发生连续的变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。 二、实验材料、仪器和试剂 1、实验材料 干酵母 2、仪器

(1)高速离心机 (2)恒温水浴锅 (3)层析柱(1.0cm×16cm)(4)梯度混合器(5)部分收集器 3、试剂

(1) 95% 乙醇溶液 (2) DEAE-Sepharose Fast Flow (3) 1mol/L醋酸溶液 (5) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)

(6) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3 三、操作步骤 1、破碎细胞

取15g 干酵母，加5~10g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30ml去离子水，研磨30min，在冰箱中冰冻约20~30min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次，加5ml去离子水，置离心管中，12000r/min离心15min，留0.5ml上清液为第一组分。 2、加热除杂蛋白

将上清液倒入三角瓶，将1mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入到50℃的水浴中，保温30min。在温育过程中，注意经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000r/min的转速离心20min，取0.5ml上清液为第二组分。弃去沉淀。 3、乙醇沉淀

量出上清液的体积，并加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30min)，于冰浴中温和搅拌20min。然后以12000r/min的转速离心25min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6ml 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5min以上)使其完全溶解，以12000r/min的转速离心25min，取出0.5ml上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步骤操作。 4、上柱

装DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱，上样后用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3) 平衡，然后用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0~1mol/L)洗脱，层析柱连上线性梯度混合器，混合器分别装30ml 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)和30ml含有100mmol/L NaCl的0.08mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)，每1min收集1管。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm下的光吸收值，并用尿糖试纸进行半定量测定各管的酶活力，将最高酶活力的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。

用尿糖试纸进行半定量测定：

在点滴板中滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置20min，浸入尿糖试纸，1s后取出，60s钟比较颜色的深浅，与比色卡对照。 尿糖试纸的原理：

尿糖试纸使将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶和无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧。原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。当这种酶试纸与溶液（或尿液）相遇时，很快就会因溶液（或尿液）中葡萄糖含量的少到多而依次呈现出浅蓝、浅绿、棕或深棕色。尿糖试纸是固定化酶实际应用的范例之一。

四、结果分析

以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、酶活为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图。 五、注意事项

梯度洗脱装置中的贮液瓶和混合瓶两者容量应相等，且置于同一水平位置。混合瓶装起始洗脱液，贮液瓶装高浓度洗脱液。洗脱前先开动搅拌器，后开启连接两瓶的活塞，这样使混合瓶中的洗脱液呈直线式递增。

圆盘电泳测定纯度

一、原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electrophoresis，简称PAGE)根据其有无浓缩效应分为连续的和不连续的两种。前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要有电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中的泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。下面就这3种物理效应分别加以说明。

（1）电荷效应：各种样品分子按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极、以一定速度泳动。

（2）分子筛效应：相对分子质量或分子大小和形状不同的样品分子，通过一定孔径分离胶时，受阻碍程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。相对分子质量小、形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力较小，移动较快；反之，相对分子质量大、形状不规则的分子在电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过程中的情况不同。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：

①由于两层凝胶孔径不同，样品向下移动到两层凝胶接口时，阻力突然加大，速度变慢，这样就在两层凝胶交界处使待分离的样品区变窄，浓度升高。

②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH值为6.7，下层分离胶的pH值为8.9。HCI是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都发生电解，Cl-布满整个胶体。待分离的样品加在顶部，浸在PH值8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子(前导离子)。在pH值6.7的条件下，解离度仅有0.1%～1%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后面，成为慢离子(尾随离子)。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的接口。在pH值6.7的条件下，带有负电荷的样品其有效泳动率介于快、慢离子之间，被夹持分布于接口附近，逐渐形成一个区带。

由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区及低电导区。因为电位梯度U、电流I和电导率k之间有如下关系：

U=I/k

所以，在电流恒定条件下，低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于样品和甘氨酸慢离子，使其加速前进，追赶快离子。本来夹在快、慢 …… 此处隐藏：3482字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……