蛋白质及酶工程试验(3)

凝胶放在盛有固定液的试管中固定30min，再转入染色液中染色30min，然后用脱色液浸泡至蛋白区带清晰为止。 四、结果分析

观察并记录实验结果，判断酶的纯度，画出圆盘电泳酶纯度的检验结果。 五、注意事项

(1)注胶前应检查准备好的玻璃管是否有漏。

(2)加满胶液的玻璃管应尽量放直静置，以使凝结后的胶面平整并与管壁垂直。 (3)脱胶时注意勿使针头损伤凝胶柱而妨碍观察谱带。

实验四 酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究 一、原理

酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其K m值也不同，K m值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，K m值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；K m值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。

酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，其中又有可逆抑制和不可逆抑制两种类型。而可逆抑制又包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如K m,Vmax等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。 二、仪器和试剂 1、仪器

(1)恒温水浴锅（2）电炉（3）722分光光度计 2、试剂

（1）0.2mol/L乙酸缓冲液 （2）0.5mol/lL蔗糖溶液 （3）8mol/L 脲 三、操作步骤 1、时间作用曲线

取试管编号，按下列顺序加入各种试剂，待测酶样用组分4，其稀释倍数以酶活力测定时的数据为准。 试剂 管号 CHO—(CH)—231 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 — 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.7 1.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 — — 0 1 2 4 8 10 12 15 20 25 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 置沸水浴20min

CHO???? 加入顺序 0.2mol/L乙酸缓冲液（mL） 0.5mol/L蔗糖溶液（mL） 水（mL） 酶液（mL） 保温时间（min） Nelson试剂（mL） 砷酸钾试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 A510nm 以还原糖的量（μmol）为纵坐标、时间为横坐标作时间作用曲线。 2、底物浓度的影响 取试管编号，按下表加样。

试管 加入试剂顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.2mol/L乙酸缓冲液（mL） 0.5mol/L蔗糖溶液（mL） 水（mL） Nelson试剂（mL） 酶液（mL） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 0.02 0.04 0.060.08 0.10 0.2 0.4 0.2 0.4 — 0.6 0.58 0.56 0.540.52 0.50 0.4 0.2 0.4 0.2 — — — — — — — — — 1.0 1.0 — 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — Nelson试剂（mL） 室温下放置10min 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 — — 1.0 置沸水浴20min后冷却 砷酸钾试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温5min后加入7mL水比色 A510nm 计算个试管中的蔗糖浓度和反应速率V（单位：），用反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算K m和Vmax。 3.脲对蔗糖酶的抑制

取试管编号，按下表加各种试剂。 试管 加入试剂顺序 0.2mol/L乙酸缓冲液（mL） 0.5mol/L蔗糖溶液（mL） 8mol/lL脲（mL） 水（mL） Nelson试剂（mL） 酶液（mL） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.2 0.4 0.2 0.4 — 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.45 0.43 0.41 0.39 0.37 0.35 0.25 0.05 0.25 0.05 0.85 — — — — — — — — 1.0 1.0 — 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 室温下放置10min

Nelson试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 — — 1.0 置沸水浴20min后冷却

砷酸钾试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 A510nm 以反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算出表观K m、Vmax、Ki，说明其抑制类型。 四、注意事项

1．研究酶的活力应以酶促反应的初速度为准。

2．本实验采用的是一种定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作带来的误差。因此，在配置各种底物浓度时，应用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性。各种试剂的加样量也应准确，并严格控制酶促反应时间。

实验五 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法

【原理】

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大

光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。 【试剂】

（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；

（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在 …… 此处隐藏：1799字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……