蛋白质及酶工程试验(6)

1．邵长富. 软饮料工艺学，中国轻工业出版社, 2005. 2．汪东风. 食品科学实验技术，中国轻工业出版社, 2006

实验九 原果胶酶的提取与活性测定

一、实验原理与目的

原果胶酶在食品、酿酒、环保、医药、纺织及洗涤剂行业应用十分广泛。 盐析是通过破坏蛋白质表面的亲水基团和带电颗粒而使蛋白质发生沉淀的方法，不同蛋白质分子颗粒不同，故盐析所需要的浓度不同，从而将蛋白质分离。

通过硫酸铵逐级沉淀原果胶酶进行初步的分离纯化，通过凝胶层析法进一步分离纯化。学习果胶酶的提取方法，并测定果胶酶的酶活。

三、实验材料与设备 1. 实验材料

原果胶酶工程菌、硫酸铵、考马斯亮蓝R250、原果胶、甲醇、醋酸缓冲液、BMGY培养基 2. 实验设备

电子天平、恒温水浴锅、可见光分光光度计、透析袋、凝胶Sephadex G-75

三、实验内容

1．果胶酶粗酶液的制备

挑取酵母原果胶酶工程菌单菌落，接种于装有25 mL BMGY培养基的250 mL 摇瓶中，在30 ℃、250 r/min 条件下培养约18 h，然后室温下6 000 r/min 离心5 min，收集菌体，用mBMMY 诱导培养基(约200 mL ) 重新悬浮菌体，使OD600约为1.0；将上述菌液置于1 L 的摇瓶中，用双层纱布封口，置于30 ℃ 、250 r/min 的摇床上继续培养，每24h 向培养基中添加甲醇至其体积分数为1%，诱导培养96h，4℃、6 000 r/min 离心20 min。收集上清液，即为原果胶酶粗酶液，于4 ℃保存备用。 2．原果胶酶粗酶液的硫酸铵沉淀

取9份50ml果胶酶液粗酶80ml离心管中，加入硫酸铵粉末，使离心管中硫酸铵的饱和度分别为0、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%和90%，4 ℃静置过夜, 10000 r/min 离心20 m in，收集上清液, 4 ℃保存，沉淀用

10 mL 醋酸缓冲液（pH 5.8） 溶解，然后在同种缓冲液中充分透析，检测上清液和透析处理液中原果胶酶的活性。

测定随着硫酸铵饱和度的增减，上清液中酶的相对活性的变化情况，并标出在饱和度为多少时，上清液中酶活性下降最快，这时表明原果胶酶沉淀量在相应增大；当硫酸铵饱和度超过某一数值时，上清液中原果胶酶活性下降呈现出减缓趋势，此时表明原果胶酶已经基本沉淀完毕。在硫酸铵饱和度达到此数值时，原果胶酶回收率，继续提高饱和度，原果胶酶的回收率基本不变。 3．Sephadex G75 凝胶柱洗脱

取经硫酸铵沉淀、透析和浓缩后终体积为2 mL 的原果胶酶液加入到充分平衡的凝胶中，然后用醋酸缓冲液(pH5.8) 洗脱，控制洗脱速度，建议为0.3 mL/min，每3 min 收集一管，测定每管中的蛋白质含量和原果胶酶活性，当检测不到原果胶酶活性时，终止洗脱，并用测得的蛋白质含量和酶活数据绘制凝胶过滤曲线。 4．原果胶酶活性测定

取10 mg 原果胶，加入0.95 mL pH 5.8 的NaAc-HAc 缓冲液和50 uL适当稀释的原果胶酶提纯液，在37℃下保温1 h，冰浴以终止反应，10 000 r/min 冷冻离心10min，取上清液，在530 nm 波长下测定上清液中的果胶物质。

在上述酶反应体系中，每小时催化原果胶生成相当于1umol半乳糖醛酸的果胶物质的量，定义为一个酶活单位(U )。

四、思考题

1. 利用盐析方法提取酶的原理？ 2. 酶的其他分离纯化的方法有哪些？

实验十 层析柱装填及柱效测定

一、实验目的和内容

目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2. 熟悉凝胶层析的一般过程；

3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填； 2. 凝胶柱柱效测定；

3．凝胶再生的方法。

二、实验仪器和试剂 1. 实验仪器

层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管 2. 实验材料和试剂

Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）

三、实验步骤

清洗层析柱

测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积

根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量

称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS 在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去

用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出

关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液 （重复使用的填料，从此步开始）

边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降

等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积

待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口

通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)

始终保护凝胶上端有一段液体

准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪

打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切

沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免

打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子

按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次

加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽

将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置

洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/L pH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)， 计算单位高度的柱效 （参考完成时间16：00）

柱效计算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2

其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。

[Sephadex G-100每米理论塔板数为3000～6000]

四、注意事项

1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

将床面凝胶冲起

（参考完成时间11：30）

2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。

3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。

4. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。

五、演示

（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法

1. 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。

2. 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。

3. 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。 4. 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。

5. 把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过 …… 此处隐藏：1920字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……