非放射性EMSA实验技术的专题讨论 - 图文(6)

蛮大的，有80多KD，所以shift条带很靠近上缘呵呵，非得探针跑出去才能把shift条带分开。能不能发张图看看啊？下次拷过来看看，因为我们实验室用的是CCD，管理员不让随便插U盘拷数据，怕中病毒，要拷也得联系值班老师太麻烦了，所以一直留在电脑里嘿嘿噢, 冷CCD那种啊,呵呵,不错,那套仪器挺贵的, 我们实验室也是用冷CCD,呵呵,

不过冷CCD仪器对底物的灵敏度要求比较高!我用pierce的盒子做emsa，标准品做出图之后，再用抽提的核蛋白做（1.2ug\%ul），蛋白上样3ul，100v电泳1小时，380ma转膜50分钟，超净台紫外灯10cm照射15分钟，结果曝光出的片子上只有几个芝麻粒的黑点，请问各位大侠我的问题出在哪里？谢谢我用的尼龙膜是砝码西亚（amersham）的0.45u,请问有用过的吗？大家都用的哪种膜啊？谢谢拍绿色荧光标记用什么？CCD吗？拍绿色荧光可以用CCD啊, 不过激发光源不同而已!一个是化学发光,一个是激发荧光,虽然光的来源不同,但是CCD都可以捕捉到图像!哦，那么用绿色荧光标记探针就可以直接用胶拍照了？那岂不是很简单可以这么讲,不过我自己觉得转运到膜上更好些,以前做过GFP的荧光蛋白,用我们的成像系统成像效果还不错,不过在胶上不好操作, 后来转到膜上感觉还不错,还好保存,呵呵!

主要是激发光源合适,要是激发光源不合适,那就完蛋了!

呵呵请问各位有谁知道PIECE盒子里的blocking buffer的配方是什么啊？我的用完了，急用啊！blocking buffer 等后面的一套东西, 还是买kit比较好, 大家都能配, 那就不叫kit 了, 呵呵谢谢楼主的帖子和回复，让我受益不少。

但是我一丝不苟的按照楼主的方法进行了实验仍然没有得到binding条带，只能看见很深探针的条带，以下是我的实验条件和问题。

1 我用的试剂盒是PIERCE的，检测的是NF-KB和AP-1的结合带都没有出来。

2 上样的核蛋白是从HUVEC细胞中提取的，用的碧云天的核蛋白提取试剂盒，上样量从2－10ug都检验过。

3 胶配的是6％的，APS加的量多了些，20ml的体系加了300ul，会有影响么？

4 电泳的设备是Biorad，8×8×0.75cm，0.25×TBE的缓冲液，电压150v，电流才6到7m A，电流小会不会影响复合物的迁移，是不是和胶比较薄有关系？ 5 转膜的条件是390mA，1h。

6 紫外交联仪120mJ/cm，1分钟。奇怪的是交联完了以后能看见离加样空很近的地方有白色的条带，封闭完了以后就看不出来了。 7 探针是2年前合成的，如何检验探针的质量？没有降解或者断裂？我用标记biotin和未标记的竞争探针跑了琼脂糖电泳，发现标记的确实比没标记的跑的慢一点，但是没标记的探针出现了两条带，标记的只有清晰的一条。这个实验能否说明探针没问题？ 8 我显的片子上在离探针很近的地方有一条带，但是估计是非特异的条带。

我的问题有可能在哪里了，做了半个月了都没有得到结果，非常的着急啊！万望高手予以指导，大家也可以来讨论以下我的失败原因。多谢！@_@胶上不好操作什么意思？难道不是把胶剥下来直接拍照就行了？那个。。其实根据原理就可以知道配方是什么。你后续的试验使用SA-HRP与膜杂交那肯定跟核酸杂交不同，不需要加鱼精DNA封闭，只要用1%BSA，0.02%Ficoll和0.02PVP就行了，也就是分子克隆上写的Denhardt's液，但是三样东西单买都蛮贵的-。- 我用牛奶封闭效果不太好，毕竟内源生物素太多了，看上去膜很脏。EMSA非放射性法贵的就两样东西，poly dI:dC和封闭液，其他的便宜地一塌糊涂。做纯化的蛋白，如果不要求背景特别干净，就用1%BSA+0.3% Tween-20封闭就行了，而且不用poly dI:dC，那比做Western还便宜。帮忙分析下我的结果

谢谢啊 啊啊请问下BLOCK BUFFER 能重复利用吗？好几天没来了，呵呵 你得问题好多啊！！！

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在坛子里面看看，基本都有答案，回头我PM你，给你回答，呵呵！呵呵，这话我不敢说！当然可以，不过page那个胶貌似很容易就碎掉了，呵呵，而且交面光滑容易反光，

转在膜上容易保存和成像，呵呵LWP1981,你好，我想问问你们有没有自己配过Loading buffer做过EMSA，我自己配了觉得拖尾很严重，我用过两个配方一个是10ml 100%甘油+2ml 0.5M EDTA(PH8.0)+微量的溴芬兰，还有一个是250mM Tris-HCl(pH7.5) 0.2%溴芬兰，40%甘油，还有用过跑DNA的6*Loading buffer也试过，都觉得拖尾比较严重，不知道你们平常做这个实验的时候，有没有碰到拖尾的情况，你们是怎么优化条件的？谢谢一班你买的kit中都有 loading buffer 啊， 为什么要自己陪啊， 另外做WB， DNA电永等的loading 不能用来做EMSA， 不同的东西！感谢分享经验。 我遇到的问题是：

1.shift 条带很好，却做不出好的supershift 条带。抗体是文献中常用的抗体。哪位高人有抗体孵育的优化经验？是先与probe孵育好，还是先与核提取物孵育，宜或三者共同孵育？有时间要求么？

2.mutant probe设计有原则么？我当时不懂原则，按照文献葫芦画瓢，识别位点（8nt）CC变为TT，结合的也很好，信号仅轻度减弱。 谢谢！感谢分享经验。 我遇到的问题是：

1.shift 条带很好，却做不出好的supershift 条带。抗体是文献中常用的抗体。哪位高人有抗体孵育的优化经验？是先与probe孵育好，还是先与核提取物孵育，宜或三者共同孵育？有时间要求么？

2.mutant probe设计有原则么？我当时不懂原则，按照文献葫芦画瓢，识别位点（8nt）CC变为TT，结合的也很好，信号仅轻度减弱。

谢谢！你好，请问一下做EMSA，加入抗体后，shift条带消失了，但supershif 条带并未出线，胶孔里面有条带.shift条带就很大了，是不是supershif 太大跑不下来啊。如果延长跑胶时间，free probe 跑没了是不是没有关系啊，谢谢。LWP1981 有机会帮我看看做的EMSA结果

骨骼肌的NFkB新手做我觉得还是用试剂盒比较好

Pierce的不错呵呵，盒子，做出来就好，做不出来就没得好！ 呵呵，做了两次预实验，显影都是白板一片，很郁闷：（

生物素标记的探针是上海博尚合成的，双链都标记了，但是都是只标记5·端，自己退火合成的双链，跑过琼脂糖胶条带很清晰。KIT是碧云天的，探针浓度是200fmol,蛋白20ug，探针用的是sp1的通用序列。4%和6.5%的胶都做过，电泳是100V1h（BIORAD的装置）,冰上转膜380mA40分钟，转膜后溴芬兰非常清晰的转上了。紫外交联是用超净工作台10cm10min，因为时间长，不能保证膜不干，我中间还滴了几滴0.5xTBE上去。后面的步骤严格按KIT了，显影的时候整个盒子里面都有荧光，但是膜拿出来就没见荧光了，显影连游离探针都没有。

我想转膜应该没什么问题吧，溴芬兰很好的，紫外交联是按楼主说的做的，是不是不能中途滴水上去？怎么检验探针的生物素标得怎样？请知道的站友指导下罗！是不是我只标记了一端需要加大探针浓度啊？***！国外现在验证某种核酸和某一蛋白相结合的常用方法是原位杂交和免疫染色。原位杂交显示核酸的定位，免疫染色显示蛋白的定位。如果两者的定位一致，那基本能肯定两者相互作用。

有没有这样的文献报道，能否提供参考一下。这个精度要求很高啊。要对一个转录因子在核内进行精确定位。请LWP1981帮忙看看

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谢谢谢谢fangweibin119！好像电泳时间比较短？？？探针比较重要，要是合成的质量不好，怎么也做不出来！

交联的时候膜干了没事，封闭后不能干！！电泳一个半小时左右做了6、7次才发现有这么精华的文章，真是 …… 此处隐藏：4159字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……