非放射性EMSA实验技术的专题讨论 - 图文(4)

知道是不是蛋白质的量多了？我这个蛋白分子量是12KDa左右。有经验的朋友帮帮忙啊！搂住,我最近要做st的转录因子,准备用的VIAGENE公司的盒子,他们的盒子里面也包扩了标记好的探针和结合膜,不用自己在找探针等东西了, 你用过没有,给点意见,不知道有没有人用过Millipore的EZ-TFA试剂盒呢？号称是替代EMSA的产品，实际效果怎样？我就是在英骏合成的,给我的是粉末,你说的复性液10乘的浓度也很低是不是可以用PCR buffer来配啊? 那引物可以用水溶吗?我现在用PIERCE公司的试剂盒做NF-KB的EMSA,我想问的是上样电泳时,上样缓冲液对NF-KB和探针的结合到底有无影响.我们最近都是按说明书上说的每个20ul反应体系中加了5ul上样Buffer.很多文献和园里的都说上样Buffer可干扰NF-KB和探针的结合,有用过PIERCE公司的试剂盒做NF-KBEMSA的大侠,能否给点意见.有图吗,我们也发现最后发光显色后在加样孔下0.1~0.3cm处有很亮的条带,不知道是什么?正考虑是否是蛋白是否过量呢,你有图吗,一起看看,望能找到答案请问你这张图中NFKB的阳性带到底是哪条?条带很多,能否给我们表一下,太感谢你了!!你可以考虑用15ul，10ul反应体系试试，我平时经常用10ul和15ul的，

另外加样的时候把孔清理干净，把加完loadingbuffer的样品高速离心一分钟在上样！我们实验室有几年了做EMSA也是用的是VIAGENE的盒子，好处就是配套齐全，不用自己在摸索条件或者购买结合膜等之类的不全和试剂，尤其是他提供了调剂好的探针工作液和成熟的实验条件倒是最大好处！

但是不好地方就是仅仅限制在NFKB，ST,AP-1 ，等他们有的几个转录因子上，如果要是新的转录因子的话他就没有优势了而PIERCE的就占了优势，但是PIERCE的劣势也是确是在盒子里东西不全，还得自己购置结合膜，制备探针等，尤其是制备探针有时候煞费心机，呵呵，

所以两个公司的有所互补，应该取长避短！

你可以根据你自己的需要来综合利弊挑选，要是在他们的范围内的话，我觉得还是viagene的就不错，要是你做别的转录因子PIERCE的就不错！loading buffer是对反映体系有一定的危害。危害主要是里面的溴酚蓝对protein/DNA复合物有抑制作用，

所以在这点上客观的来讲，我并不赞同PIERCE的loading buffer， pierce的loadingbuffer 溴酚蓝含量很多，在这点上我倒是比较倾向VIAGENE的，loadingbuffer中的溴酚蓝很淡！呵呵，这个图是我做的原图，里面有阳性，阴性，竞争，supershift， 很简单靠上面就看的出来！LWP1981，你好，我想请你帮我看看我的结果，我做EMSA也有一个多月了，但是做出来的东西总是不尽人意，我是自己在公司合成的探针，用的PIERCE的KIT，碰到的问题是200倍非生物素标记的探针总是无法完全竞争掉，于是我用了500倍，1000倍，可以竞争掉一个区域的条带，但是我需要做的是该探针和两个转录因子的结合。泳道分别是Free probe ,蛋白1+probe,蛋白2+probe，蛋白2+500倍非生物素probe，蛋白2+1000倍非生物素probe，蛋白+抗体1，蛋白+抗体2。是不是我上面的那条带是非特异性的？楼上的，没看到你的竞争有什么效果啊！！！还有抗体那一栏的！！！ 还有就是注意一下，冷竞争反应中加入探针，不只是量的不同，顺序也是不同的！！！谢谢，是的，我做了几次都是这样的结果，冷竞争竞争不掉。也不知道是什么原因，冷竞争反应中我是先加非标记的探针和核蛋白孵育二十分钟以后再加的生物素标记的探针的。顺序应该是这样的， 我们通常用20－50倍就可以竞争掉了！ 如果竞争不掉，你哪个可能就不是 NFKB阳性了，建议最好弄个阳性对照验证一下看看！请教楼主及各位前辈： 我即将要做NF-KB的EMSA,看到大家的帖子，感觉很幸运。

在此有一个问题想请教：我们实验室只有用来做western blot的电泳仪和转膜仪器，请问用这个可以做吗？还是需要买特殊的仪器？

谢谢！不好意思，在请教个问题：supershift用的抗体是抗转录因子的吗？这个方法和不叫

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抗体的有何利弊？

谢谢！做非反射性的EMSA也用不到别的特殊的仪器，有WB的那套装置就可以做了！ 至于抗体，EMSA有专用的EMSA的抗体，你可以，这个抗体一般不同于WB的！十分感谢：）各位大侠：

我是新手，准备测NF-KB活性，用PIECE公司的试剂盒，有谁在用或者用过啊？能否给点资料啊 这是我的QQ：76273135 谢谢啊我想问问你们做EMSA用的核蛋白是用KIT抽提的吗？用的是哪里KIT？我用的PIERCE的胞浆核蛋白抽提试剂盒，做的结果不满意，是不是因为核蛋白的质量不高？回头我给你中文操作步骤,呵呵目前市场上KIT很多的, 还是用专用的比较好点, 不过觉得PIERCE的比较贵,呵呵

viagene的!EMSA有专用的EMSA的抗体？请问下，这种抗体有什么特殊要求？我是刚开始准备做NF-KB活性检测，需用PIECE公司的试剂盒做EMSA，新手上路，啥也不知道，也没人教，只能拿着说明书做，各位大侠能否不吝赐教啊，这是我的qq：76273135请问各位前辈：EMSA试剂盒哪家公司的比较好？参看前面的帖子回复,主要看你做什么转录因子了, 市场上好几个,各有各自的好处,

根据自己的情况定了, VIAGENE, pierce,等的有EMSA专用的抗体,他们的抗体说明书上有, 我们用的是SANTA

的,浓度很高!摊子里面资料多了,可以自己学习学习,呵呵,慢慢来刚开始做EMSA ，买的PIECE公司的试剂盒做NF-KB活性检测，各位大侠有中文操作步骤吗？我的邮箱是xiaoying0218@yahoo.com.cn,不胜感激请教楼主关于提核蛋白的问题，我要做的是大鼠肺组织，买了pierece的核蛋白提取试剂盒，请问一般每个标本取多少mg组织来提？因为我的标本有七十多个，取的组织多了怕试剂盒不够用，取得少了又怕提的蛋白不够，谢谢了150-200mg150-200mg的话，按照pierce的说明一个试剂盒做不到二十次，可是我有七十多个标本呢，怎么办啊？我门通常是大概在150mg左右来提取核蛋白的,适当少点没事,但是不能少太多啊!!!请问LWP1981

一般来说要加抗体的话需要多少ug呢? NF-kB的亚基那么多是不是都要进行实验? 还有想请教一下加抗体的具体实验步骤

是先将体系配好,加入抗体和核蛋白抚育30min后再加入探针 还是在核蛋白与探针抚育后加入抗体?

还想请问一下 我用的200倍冷探针竞争,能明显使条带减弱,但是不能完全竞争掉,是不是可以加大倍数? 多谢!！ ！

我们通常用2ug，P65,P50抗体都可以啊！ 探针完后在加抗体赋予，

竞争也可以加大倍数的！LWP1981 请教一下，activemotif的核蛋白提取试剂盒是不是很烂？？

我的游离探针非常漂亮，整个膜也是清晰（没法扫描抱歉），但是就是没有结合带，我测核蛋白浓度的时候发现不是280吸收，而是310-320nm的吸收峰，这是怎么解释？适用的是activemotif的核蛋白提取试剂盒！！！activemotif的核蛋白提取试剂盒 裂解细胞核的时候使用的是去污剂，不知道对于蛋白探针的结合有没有影响？？

LWP1981 使用的哪个试剂盒？activemotif用过么？是不是有些问题？？？？看大家都遇到这么多问题，真庆幸我做一次就做好了。去污剂如果要用，就用特别柔和的那种！ 我用的是VIAGENE的，

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当然去污剂用的多了也可以使蛋白变性的拉！！！有没有人知道哪家公司代理做EMSA啊我是想做miRNA和蛋白之间的结合关系的，谢谢。

或者指导下这方面的方法也行。有好几个都在做呢，哈哈，请问各位，为什么我的游离探针会有两条带，这个应该不是shift的条带吧？提核蛋白时，大 …… 此处隐藏：7155字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……