非放射性EMSA实验技术的专题讨论 - 图文(5)

谢谢！

预电泳120v,1h；电泳150V.你要说的是这样，对不？如果是120mA, 150mA,就不对了！电泳用恒压，转膜用恒流。我是湿转，不知道半干转膜的条件。

关于胶片上什么都没有，可能是标记探针的问题，可能是紫外交联不好，还有就是后面HRP的浓度，孵育时间。鉴定一下你的探针，如何？楼上的，能不能发图看看？ EBNA是什么？抱歉不懂，能说说么？ 哦，应该是楼上楼上的呵呵谢谢valleylily!

做了两次预实验，结果都一样，什么也没有！除了转膜，其他条件都跟你一样（我用的就是kit里的样本探针），电泳恒压转膜恒流，紫外用紫外交联仪和紫外灯下都照过，可就是不出来。

着急啊~老板还老催！~~~~55555555555

是不是半干转真的不行啊？拜托大家想想办法啊~~~~我的图片：

1 2 3是Pierce kit里面的EBNA对照，这是用来检测实验体系的，如果这个都做不出来，实验系统肯定有问题。lane 2 shift, 昨天的信号太强，今天减少上样量，就不这么黑了。 4 5 6 是我的一个样品。中间一个lane，出现shift band. 和qingshi一样，上样孔下面有条带，我觉得可能蛋白和探针的非特异性结合，因为lane 4没有蛋白，也就没有这样的条带，而在lane 6也没有被未标记探针竞争结合掉。同样，qingshi的第一道也没有这样的条带。我的是组织提取的核蛋白，是不是可以减少蛋白量？请大家帮忙看看，提点建议！再次感谢这个帖子，少走了很多弯路！我还有一个问题：怎么分析各组间shift的差异？ 条带的深浅？宽度？shift的位置？这些是不是考虑的因素。

另外，看以前的帖子，楼主提到了super shift, 是不是加了抗体？有机会请教一下相关的信息。sudan919 ：你用的kit 里面有像pierce这样的control system么？如果有，做一次不就知道方法有没有问题了？valleylily 谢谢分享讨论 你说的很对，

1 如何去掉加样孔中的残留？难道真的是蛋白上氧量太多了？ 2 如何进行不同样品间的定量比较，是不是控制蛋白的上样量？

望讨论哇噻，几天没来，这里好热闹！ 哈哈那个盒子里面的CONTROL只能用来验证试剂盒是否工作，不能用来做真正的对照，切忌！很明显的，加样孔大量残留啊！关于残留的问题和蛋白上样的量关系不是很大，我以前做过10ug上样，也没什么残留现象！倒是注意操作中的细节！

偶们实验室用的VIAGENE公司的EMSA盒子比较多，比较有经验，关于PIERCE的盒子里面的其他的配置，偶不是很清楚，也很少用pierce的，所以帮不上忙的地方大家就讨论拉或者找pierce的技术支持解决，呵呵，我用的pierce的核蛋白提取盒子，没用蛋白酶抑制剂，用来提取原代悬浮细胞，步骤如下：1.取20ul细胞(2*e6) 1000转离心3分钟，2.去上清（但是我没看到分层）就把1.5ml ep管底部的底部保留，后面的就严格按照pierce的步骤做，但是提出的蛋白很少，有时候甚至几乎测不到，请问我的问题出在哪里？我也是这个意思，control 出来了，至少证明实验步骤和试剂盒没有问题。那就是样品，探针等的问题吧！qingshi, 谢谢！这的确是个问题。我以前也觉得加样孔残留，但是自己做过，和看过结果后，我对加样孔残留的说法持保留意见。

条带显示的是biotin-DNA，对吧？如果残留，那么所有的泳道都应该有，但事实是，只有加了蛋白提取物的孔有，而且这个位置已经出了上样孔，我的片子上，还不止一条呢！理论上，如果所有的探针都没有结合的话，都应该跑到溴酚蓝的位置。上面的条带，我觉得可能是-蛋白和标记探针的非特异性结合-很强，连百倍浓度的非标记探针也不能竞争掉。是不是跟

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蛋白量以及poly( dI:dC) 浓度有关？

我的是组织蛋白，上样是15ug, 比较多，因为不是用pierce的试剂盒提的，而且放在-80半年多了，所以担心核蛋白的浓度，以及杂蛋白。

想试试降低蛋白量，提高poly( dI: dC)浓度，但pierce的poly( dI: dC)实在太少了。 请有楼主和战友们指正。谢谢！看来下次要试试viagene的盒子，多少钱?看到这个帖子之前，就订了pierce的，所以……我倒是希望自己能积累点pierce的经历，可以和大家分享！没有用蛋白酶抑制剂，这是主要问题吧！

还有离心后没有看到细胞，说明细胞太少了。一般100mm dish or 25T的培养瓶长满，悬浮细胞很多呢！至少能看到比火柴头大的团块。离心3分钟，有点短，5-10min,试试？没蛋白酶抑制剂你也敢用啊，呵呵，小心很快降解了啊，蛋白酶很厉害的，呵呵 做emsa细胞不能太少啊！ 否则得到的核蛋白会不够用的！祝大家，中秋快乐！！！ 哈哈！比较各个样品间的tf差异如何做的？是不是把总抽提蛋白的量都调整到一致然后看shift带的强弱？？ 楼主

valleylily 等。。

你们怎么做得呵呵，请教了。如图，这次很不好，还是两个问题：

1 比较各个样品间的tf差异如何做的？是不是把总抽提蛋白的量都调整到一致然后看shift带的强弱？？

2 加样孔中的残留如何去除？

尤其是第一个呵呵，各位多多发言了。1. 我也是这样做的。

2. 我也没有找到好办法。最近开了一次会，看到别人做的，也没有能消除，不过背景低多了，可能他做的是细胞。我现在头疼的是背景很高。跑胶的时候要不要时间长一点？上次试着降低标记探针的浓度，背景好看了，但结合条带没有出来。挺郁闷的！1 比较各个样品间的tf差异如何做的？是不是把总抽提蛋白的量都调整到一致然后看shift带的强弱？？ －－－－－－－－－－－

如果调整量到一致了，怎么定量比较shift带的强弱？非变性胶当天配制了没有用，能不能四度冷藏到第二天用？？？

有人做过这种事情么？能行么？qingshi, 我没有做过，不过变性胶经常4度过好几天再用！用封口袋装好，里面放点蒸馏水，防止胶干掉。按道理是可以的，还有预制胶卖呢，可是没有经验，不好说，到时候找不到原因。

qingshi, 你做的是组织核抽提物么？蛋白量用了多少？我出现binding 信号不强的问题，就加大了蛋白量，发现信号反而弱了。现在通常用15ug，探针用200fmol，总觉得蛋白量太多，但又不敢随便改。你分别用多少呢？我看你片子底端的游离探针比我的好看多了。 关于加样孔下面的条带，我看国外的网站上讨论过，大家众说纷纭，总之几个细节，1冲洗加样孔，2.loading buffer里的溴芬兰（我尝试过不用loading buffer 直接上样，binding信号强了，似乎没有解决加样孔残留问题）3，有人说新鲜制备双链探针，解决了问题了，他也不知道是不是这个原因，我倒想尝试一下。 关于定量，我看文献上就是这么做的。

做出shift band来似乎不是很难，但漂亮的结果很难，重复漂亮的结果更难！

谢谢你的分享!楼主最近也没有空来了！嗬嗬！我的问题真多啊！可以冷藏一宿，不过要全部放在电泳夜中保存，问题不大！呵呵，最近比较忙，呵呵，

结合反应的蛋白用量是有一定的限制的，并不是加的越多越好，太多了，结合效率会大大降低的！！！切忌！

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loadingbuffer 还是加上好，否则容易散样现象！

至于残留，我觉得影响因素还是：凝胶制备杂质多，样品中杂质多，可以离心解决，再就是冲洗加样孔不干净，可以试试！至于残留，我觉得影响因素还是：凝胶制备杂质多，样品中杂质多，可以离心解决，再就是冲洗加样孔不干净，可以试试！ 组织蛋白真不好弄。请教楼主：

1.冲洗加样孔这个技术活有什么诀窍么？你用多大体积的移液枪冲洗？ 2.反应体系上样前 …… 此处隐藏：6896字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……