非放射性EMSA实验技术的专题讨论 - 图文(3)

用过感觉比较好才敢推荐，哈哈那我要买NF-KB的探针工作液,我不想费事,我需要可以做人和小鼠的生物素标记的探针,最好能保存时间长些.不知哪个质量好的公司肯单卖这个探针?多谢关注!!!谢谢楼主,推荐一下好的尼龙膜吧!大体说一下过程，楼主帮看看原因所在： 使用碧云天gs009试剂盒。

NF-KB探针自己标记，斑点杂交检测效率约为50％，没有纯化探针，杂交结果尚可。 但是核蛋白结合后转膜杂交根本没有信号，主要过程如下： emsa 的page胶： 5* TBE buffer 2ml 水 14.2ml

29：1 arc/bis 3.2ml 80%甘油 600ul 10％ap 150ul

temed 10ul

凝聚3小时后，上样，无溴芬兰。

（说明书上说10×的TBE buffer使用1ml，我的是5×buffer，使用2ml对么？ 是不是说明书上的10×意思是稀释到0.5×，所以我的5×buffer可以理解为10×buffer？？） 转膜

0.5× TBE buffer 作为缓冲液

380mA,60分钟。这次制冷效果不好，出现胶黏到膜上的情况了，但是我多转了两个无关蛋白，剪膜下来使用立春红染色效果很好（虽然有胶的碎末在膜上，但是蛋白条带清晰可见） 出现胶黏到膜上的情况是不是因为产热太多？？？ 交联和显色

这些步骤和检测效率的方法一致，斑点杂交检测效率感觉很好，但是不知怎么的，预实验四次了，转膜后的显色结果总是惨不忍睹，楼主及各位有什么高见？

这是最近一次结果，如下（从左到右顺序,电泳方向从上到下，无冷竞争泳道： 游离标记探针泳道 结合泳道1 结合泳道2 空泳道）：

（缩略图，点击图片链接看原图）奇怪的是，连游离非结合探针泳道也没有成形的显色，而探针直接点膜杂交显色的效率检测结果很好，为什么会这样？ 转膜和核蛋白结合有什么问题么？楼上的哥们，你写的很多，问题也很多，最起码的探针没有纯化都敢用！！！这个危害很大的啊！

纯化的问题没解决，后面的实验结果就是操作在对也不实在了！！！楼主的帖子实在太好了,我也和各位EMSA的实验同志们一样遇到一些问题

我4年前也做过EMSA,是同位素标记的,在别人的实验室,一切条件都很成熟,我就没遇到什么问题,重复三次结果都很好,文章也发表了,点值还比较高,但我对可能遇到的问题就没办法解决了.

现在我用生物素进行标记,用的碧云天的KIT,也遇到楼上一位兄弟所遇到的情况,我用KIT的自带探针检测标记效率,显色时膜上一片荧光,肉眼都可以看见.HRR的稀释比例是按KIT推荐,我怀疑是紫外交联的问题.今晚按楼主推荐超净台10cm下10分钟,HRP也将稀释浓度提高一点,试试看,有好的结果向大家报告.

也不知那位兄弟的问题解决了没有,如果封闭液\\洗涤液\\平衡液出问题就只有找公司了.有一个情况我刚忘写了

不知封闭液\\洗涤液\\平衡液各起什么作用,

封闭液\\平衡液都用的KIT的原液,洗涤液KIT推荐用重蒸水或miliQ级水1:5稀释

现在的实验室没有,我用的去离子水稀释,会不会是洗涤液没有作用,导致整张膜都发荧光为

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什么呢？

我是第一次做，所以按照盒子上的建议说不纯化也可以，我怕纯化后丢失，所以没有纯化。纯化的时候能加糖原载体么？为什么呢？

我是第一次做，所以按照盒子上的建议说不纯化也可以，我怕纯化后丢失，所以没有纯化。纯化的时候能加糖原载体么？报告大家,我今晚用没有稀释的KIT自带探针、HPR稀释比例1:4000，检测到了!!!!说明紫外交联及之后的步骤都没有问题。 不过膜上还是在暗处肉眼可见一片荧光，说明KIT推荐的HPR稀释比例1:3000过高，下次还需调整到1：5000，否则背景太深。

同时还说明了一个问题，KIT自带探针的标记效率也不高，按它介绍的最高1：50稀释根本检测不到，更不要说1：100，1：500及更低的稀释比例了。

我标记的探针纯化过，没稀释的也没检测到荧光，看来标记效率就更差了，但还是鼓起勇气往后做做看，退火后再检测一次双链的效率，然后再继续走完看看。 青石战友如果将探针纯化后能检测到标记效率再来看后续的实验吧。

其中提到的一些问题：冷竞争指没有标记的探针进行的实验，Poly dI-dClouPolydI-dC的作用楼主在前面已经叙述非常清楚;

转到膜上的是蛋白质-DNA复合物,探针,蛋白质,只有探针和结合了探针的蛋白质最后会检测到荧光;

我没有发现什么地方需要去除SDS

EMSA胶中的甘油的作用我不是很清楚,是否可以请教下楼主纯化的目的是去掉没有标记的双联, 而发光的是标记好的双联,但是结合蛋白的只要序列相同都可以结合,所以如果是阳性可能变成弱阳性,弱阳性可能就是阴性了!

没有纯化,从根上就没有过关,后面的问题就更大了!!!sds会变性蛋白,蛋白变性了就没有结合活力了,EMSA试验就失去意义了,

凝胶种的甘油主要是调节样品和胶的渗透压平衡!!!可是kit的纯化方案就是酒精沉淀啊，那不是标记和未标记的都沉下来了么？ 谢谢你的回答

另外想请教一下，为什么叫冷竞争？ 冷指什么意思？

再次感谢SDS的作用我知道,在EMSA实验中没有什么地方需要用SDS啊,当然也就不用去除

是因为青石战友有这么一问,所以我不明白他在什么地方需要去除SDS 青石战友提到的冷竞争

指的是没有标记的探针和标记的探针进行竞争结合靶蛋白上的结合位点 按青石战友的提法,冷在这里可以理解为没有标记的探针哦 有意思呵呵 那么说标记放射性探针称之为热探针了？！

我们知道emsa的装置肯定是和蛋白电泳混用的，但白点用的sds会残留的，所以我才说去掉sds，不知痕量级的sds有没有影响？ 谢谢回答，祝讨论愉快。问题1 ：

可是kit的纯化方案就是酒精沉淀啊，那不是标记和未标记的都沉下来了么？ 问题2：

标记放射性探针称之为热探针了？！ 问题3：

凝胶种的甘油主要是调节样品和胶的渗透压平衡! 如何起作用的？ 抱歉 问题越来越愚钝了青石战友用的是不是碧云天GS008KIT? 我刚发现它的说明书有个很大的错误!!!!!

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(不知以前 用过它家KIT的战友用的情况怎样,还是我自己做不出来找的原因) 我想先请问下你在进行效率检测时是在它推荐的哪一个浓度上检测到荧光的? 看你前面的介绍,你是用的点杂交的专门设备吗?

我就是直接点到膜上进行检测的,只有KIT的自带标准品没有稀释的情况下(400nM)可以检测到荧光.

按照它的说明书探针标下来顶天达到20nM的浓度,根本检测不到,更不要说后续实验了. 我已经给公司发email了,希望大家一起探讨,尽快将实验开展起来!!!呵呵,探针的制作不是那么容易的!!!尤其是自己以前没做过,然后买盒子来作,把握很不足的!!!哪里可提供生物素标记服务呀？谢谢了！可以买现成的,不过只有常用的几种!比如NFKB, SP3等谢谢楼上的，可是哪里可以买到现成的啊，碧云天不提供这种服务。我就是做NFkB的VIAGENE , 给你发了pm消息, 你自己看吧!青石战友用的是不是碧云天GS008KIT? －－－－

是的，但是我觉得我的问题是探针上。

探针也是碧云天的 好像有问题 ，但是直接点膜很好，一跑胶就非常模糊，我今天用银染看了一下，探针和蛋白结合的泳道几乎什么都没有？？？？ 而且单纯探针整个泳道黄乎乎的，真是晕死啊？难道反应过程中把我的探针消化掉了？？？？有没有这个可能？？

另外，今天重提了蛋白 但是检测显示在225和310各有一个吸收峰值，为什么呢？280周围没有吸收峰？

问题多多啊 谢谢回答楼上的战友，我也用的碧云天的标记 …… 此处隐藏：6232字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……