非放射性EMSA实验技术的专题讨论 - 图文(2)

呵呵, 不过这个不是不可以, 主要根据自己的课题来判断, 如果你觉得你的要检测的那个DNA是否会结合蛋白参与后续的基因调控, 这个结果应该也是很重要的, 因为这预示着一个信号通路的判断的关键环节!

不过我对老兄的课题不是很了结, 上面说得只是我的理解, 希望能够借鉴, EMSA试验就像楼上的老兄说得, 理论不难,但是一到了试验操作,中间的问题会很多, 如果真是条件有限, 时间有限,交给个技术成熟的公司做也是一个很不错的选择! 呵呵3.探针的制备:

又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.

先标记生物素再退火？退火时90多度的温度会不会影响生物素的结构稳定？我都是先退火再标记的不会啊, 一般都是这么操作的啊, 做的探真用了好几年了都没问题,呵呵!!! 上面那个supershift 就是用P65抗体做的生物素标记的探针,

好多关于生物素标记的资料都是先标记单练然后退火的,有兴趣可以查一下,呵呵!!!各位前辈好：

我课题也刚刚开始，是做肠粘膜损伤机制的研究的，其中就有一项指标是测定大鼠肠粘膜NF-KB的表达的，查了很多文献，发现检测方法好多，初来咋到，也不知道选哪个方法，看到各位前辈在NF-KB检测上都有相当的经验，希望能赐教，非常感谢！

我们共有60只大鼠，我想如果让公司帮忙做的话，需要多少MONEY哦，什么公司可以提供一下吗，呵呵，谢谢，谢谢！

还有留取标本时有没有要特别注意的呀？？我想请问一下EMSA显影时的压片时间一般为多长呢？

好像听人说有在-70放一个星期的，是吗？

另外我想确认一下探针的浓度，混合物里面生物素标记探针的终浓度是多少？是fmol级别吗？有用pmol级别的吗？用磷屏常温下24小搞定显影啦，而且数据直接保存在电脑上。呵呵,你做的还真是多, 不过EMSA还是比较烧钱的啦!!! 保守估计你要是找公司代作的话保守估计的一万大洋吧,呵呵

不过标本最好是新鲜的抽提组织样品比较好,如果不想自己抽提,可以直接液氮动存!!!楼上的那个仁兄是从磷屏显影来讲, 那么我最熟悉的是非放射的,就从生物素的角度来讲;

关于压片时间, 这个不容易讲 , 因为这和你的底物发光效率,生物素标记程度,等因素有关. 但是不管怎么样,一般的底物也就是30S, 1min, 2min,这几个片子时间就差不多了,如果你还有心思,可以在压个4分钟的,呵呵!

我每次做结合反映,15ul体系用探真量是50-250fmol,不过250fmol肯定是过量的!!!通常都有很多自由探真在底下!!!版主,那个PolydI;dC 可不可以不加,要是 必须加的话,在哪里可以定到,(我用的人家别人的试剂盒,里面的用光了.)PolydI;dC是结合非特异性的一些杂蛋白,否则里面会有好多非特意的带,所以最好还是加上, PolydI;dC一般都是大包装的, 你可以搜一下看有没有分装的!请问 ：有那位大侠知道化学发光法EMSA中 洗涤液的配方？good对于EMSA，我一直都有一个疑惑。 就是EMSA究竟可信性是多少？

所谓的EMSA，其实就是在体外，将某一种核酸和某一种蛋白混合在一起，然后看它们是否能相互结合。

但是众所周知，体外环境和体内环境是完全不同的。

很有可能在体内，这种核酸和这种蛋白由于细胞区域定位的问题，根本不会相遇，也根本不会有结合的事情发生。但是在体外，当它们相遇时，它们却能结合。

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也有可能在体内，这种核酸和蛋白的浓度相当的低，在这样低浓度的状况下，它们不会结合。但是在体外EMSA实验中，核酸和蛋白的浓度都增加了好几十倍。导致反应向阳性的方向进行，这种情况又该如何解释？

所以EMSA结果阳性，是能结合的必要条件，但却不是充分条件。所以个人认为EMSA的重要性其实不怎么高。

和EMSA相比较而言，个人认为ChIP（染色质免疫沉淀）的数据还更可信一些，因为ChIP起码是活体细胞实验，但是ChIP对抗体要求较高，这是ChIP自己的缺陷。 国外现在验证某种核酸和某一蛋白相结合的常用方法是原位杂交和免疫染色。原位杂交显示核酸的定位，免疫染色显示蛋白的定位。如果两者的定位一致，那基本能肯定两者相互作用。大家好

我是初涉实验室的 医学生 很多东西都不懂 很着急 实验马上就好开始了 实验 需要用到 EMSA 技术 可我不是很懂 也从未做过 希望得到你们的指导 如果有相关的资料 谢谢你们发给我， 我的邮箱 chenming830427@yahoo.com相互交流学习嘛！ 呵呵，我也正准备做EMSA ，有几个问题不大明白，请教一下：

1 请教一下楼主凝胶的配方跟蛋白的分子量大小有关系么？我的蛋白34KD，DNA片段150bp，用你提供的凝胶配方可以么？

2 最后曝光的胶片具体是什么方法？我们实验室没有人做过这个实验，并且我们做WB时用的都是化学显色法，能否具体讲一下最后的显影过程？或者说使用的是什么仪器？谢谢啦！1。我们一般做NFKB ，AP等转录因子等都是这个配置方案，有时候也用5％，6％的，不过可不能再低，再低效果就不好了。

2。非放射性的EMSA试验最后的成像和WB一样，也是用底物化学发光的方法，可以压感光胶片，也可以用化学发光成像系统成像得到电子图片，两个各有优点，呵呵！哦，这样，这个胶分浓缩胶和分离胶么？可不可以把5％，6％胶的配方告诉我呢？谢谢呀！我没有查到，我查到的NATIVE-PAGE怎么还有分离胶和浓缩胶呢？很遗憾不能亲自看楼主做一遍，会帮助我很多啊还有一个问题忘了问，我的蛋白是从细菌里提取的，包涵体蛋白，实在得不到可溶的，所以是经过变性复性后得到的蛋白并且没有纯化，EMSA试验可以做出来么？我请教一下,电泳完后,切胶转膜时如何把握切胶的分寸.谢谢大侠啊小弟最近正要做EMSA方面的内容，遇到几个问题需要向楼主请教

1.小弟做的也是NFKB，想问一下楼主，楼主的探针是自己设计和标记的么？还是有专门的试剂盒提供，小弟查了一下pierce公司的EMSA试剂盒并且电话询问过，对方说探针要自己设计。如方便的话，楼主是否可以告知您设计的探针序列及标记方法，或者介绍几个不错的生物公司帮忙设计和合成生物素标记的探针。

2.请问楼主用的是哪种核蛋白抽提试剂，能否介绍几个效果比较好并且价格不太高的。小弟初次接触EMSA相关的内容，感觉有很多地方还是不清不楚，迫切希望楼主的帮助和指导。能否请楼主留下联系方式，邮箱或者QQ,小弟的QQ是705786937，方便的话请加我，多谢。我给的做胶的资料中，你可以计算一下凝胶的浓度，我给你的是6.5％的，你可以按照比例计算一下，用双蒸水补齐其他就行！我平时用的是6.5％的！

这个不分分离胶和浓缩胶！这个不好说，只要你的蛋白天然构象没有改变，结合活性没有变化，就应该没有问题！这个站友怎么说切胶转膜啊！ 呵呵，如果多余的胶你可以切，在转啊，不过我很少切，也没怎么切过，一般都是直接转，电泳的时候留点羞愤兰做标记，掌握一下，呵呵bayunye战友做EMSA试验，港开始是比较难，因为这个试验涉及的东西太多了！

我觉得如果有现成的探针还是用现成的比较好，我们的探针都是国外定做的，回头我将我得序列发给你，这个序列都是公认的！

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相关的资料我回头在发给你！

另外你做的是细胞还是组织？啊好的，谢谢楼主！我会试试，非常感谢！看到了 …… 此处隐藏：6871字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……