诺氟沙星多克隆抗体的制备

医药

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(4):1035-1036,1069　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　刘月娟　责任校对　胡先祥

诺氟沙星多克隆抗体的制备

魏东1,2,张乃生13

　(1.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062;2.河北北方学院,河北张家口075000)

摘要　用合成的NFLX2BSA偶联物免疫成年獭兔,采用ELISA方法检测抗血清效价。结果表明:采用合成的NFLX2BSA偶联物免疫成年獭兔获得了高效价的抗血清。关键词　诺氟沙星;免疫;抗体中图分类号　TQ463　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)04-01035-02ProductionofPolyclonalAntibodyofNFLX

WEIDongetal　(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin130062)Abstract　TherabbitswereimmunisedbyNFLX2BSA.TheantiserumwasobtainedanddetectedwithELISA.TheresultsindicatedthathighefficiencyantibodyofNFLXwasachievedbyNFLX2BSAimmunization.Keywords　Norfloxacin;Immunization;Polyclonalantibody

　　诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)又称氟哌酸,化学名12乙基2

62氟21,42二氢242氧代272(12哌嗪基)232喹啉羧酸,分子式C16H18FN3O3,分子量319.24,化学结构见图1。NFLX抗菌谱广、

亚胺盐酸(EDC HCl)、邻苯二氨,均购自Sigma公司;二甲基甲酰胺(DMF)购自Genview公司;N2羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自CxbioBiotechnology公司;1%羊抗兔IgG2辣根过氧(IgG2)、,购自鼎,其他试剂均为.196孔可拆酶标板购自丹麦NUNC公司。

抗菌作用强、口服吸收快、血药浓度高、毒性小,兽医临床常见病原菌,尤其对霉形体感染有较强作用。在畜禽疾病防治上,NFLX对鸡败血霉形体病、鸡白痢沙门氏菌病、病、猪肺疫、牛乳房炎等有良好效果。用NF原体病,饲料中添加202烟酸氟哌酸以10,2,对仔猪100%。以0.005%NFLX混饮或饮水3～5d,对禽霍乱的疗效显著。另有报道,50×10-6

NFLX饮水给药,对鸡白痢的保护率和转阴率为100%,禽大

微量加样器、紫外可见分光光度计756PC型(上海光谱仪器有限公司)、高速离心机(D278532SPRVALLRC5CPLUS)、精密电子天平(LIBRORAEG2120)、磁力搅拌器(CJJ2781C型)、

HI8314型pH计、酶标仪,均为美国Bio2TEK产品(型号为ELX800)。

1.1.3　试验动物。成年獭兔2只,由吉林大学獭兔繁育中

肠杆菌肠炎治愈率高达99.8%[1]。但过量使用NFLX会导致在动物组织中产生残留,使致病菌产生耐药性,并且存在一系列的副作用。从1997年8月20日起,美国禁止将氟喹诺酮类药物作为非限制性药物使用。美国联邦法规规定禁用的兽药品种也包括氟喹诺酮类。诺氟沙星在食品中的残留

问题己经受到人们的重视。

心提供。

1.2　方法

1.2.1　NFLX2BSA和NFLX2OVA的制备。采用N2羟基琥珀

酰亚胺活性酯(NHS)法,并且略做改进。将20mgNFLX、10

mgNHS、12.5mgEDC完全溶解于1mlDMF中,于室温下避

光搅拌24h,即可得到NFLX反应液。称取BSA50mg,使之充分溶解在3mlPBS(pH7.4)中,将NFLX反应液逐滴缓慢加入BSA溶液中,并于室温下搅拌3h,然后用PBS透析3d,每天换2次透析液,以除去未反应的小分子物质。以3000

r/min离心30min,收集上清,即为制备的免疫抗原NFLX2BSA,-20℃保存。以50mgOVA代替BSA,其余操作均同

图1　诺氟沙星化学结构

上,制备检测抗原NFLX2OVA。

1.2.2　NFLX2BSA与NFLX2OVA的紫外扫描光谱鉴定。在200～400nm紫外光区,分别对NFLX、BSA、OVA的PBS溶液

笔者采用N2羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法将NFLX与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原

NFLX2BSA和检测抗原NFLX2OVA,用免疫抗原免疫兔子,以获

和2种偶联物进行扫描。具体操作参照文献[2]。

1.2.3　动物免疫方法。耳缘静脉抽血,取血清,作为阴性

得高效价的多克隆抗体,旨在为研究诺氟沙星残留奠定基础。

1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　主要药品及试剂。诺氟沙星购自中国兽医药品监

对照。背部皮下多点注射进行免疫。免疫抗原NFLX2BSA用量为1mg/只(以载体蛋白含量计算),每2周免疫一次,共免疫5次。首次免疫使用等量弗氏完全佐剂乳化抗原,以后均使用等量弗氏不完全佐剂乳化抗原,第5次直接使用免疫抗原1mg/只。从第3次免疫开始,每次免疫后7d耳静脉取血,测定效价。第5次免疫后7d心脏穿刺采血,室温静置1h,4℃下放置过夜,3000r/min离心10min,收集上清,经硫酸铵盐析法纯化[3],-20℃保存。

察所;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、乙基碳二

基金项目　吉林省科委资助课题(2000500)。作者简介　魏东(1971-),男,河北张家口人,在读硕士,助理研究员,

从事药物残留检测方面的研究。3通讯作者。

收稿日期　2006212206

医药

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1.2.4　ELISA检测NFLX抗血清效价方法。检测抗原NFLX2OVA按梯度倍比稀释包被酶标板,100μl/孔,4℃包被过夜;PB2ST洗3次,3min/次;封闭液(1%明胶200μl/孔)于37℃封闭2h;PBST洗3次,3min/次;抗血清用PBS按1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000倍比稀释,健康兔血清作为

吸收峰在276nm处。这说明在BSA载体蛋白上连接上了目的物小分子NFLX,证明偶联成功,可用作动物免疫。

由图3可知,NFLX的PBS溶液的最大吸收峰在270nm处,OVA的PBS溶液最大吸收峰在277nm处,而检测抗原

NFLX2OVA与它们中任何一方的光谱都不同,其最大吸收峰

阴性对照,同时作空白对照,37℃作用1h;PBST洗3次,

3min/次;加羊抗兔IgG2HRP用PBS作1∶2000稀释,37℃作用1h;PBST洗3次,3min/次;OPD进行显色,2moL/LH2SO4终止

在274nm处。这说明在OVA载体蛋白上连接上了目的物小分子NFLX,证明偶联成功,

可用做检测抗原进行包被。

反应,用酶标仪读取各孔OD490nm值。

2　结果与分析

2.1　抗原合成　在200～400nm紫外光区,分别对NFLX、BSA、OVA、NFLX2BSA、NFLX2OVA的PBS溶液进行扫描,扫

描结果见图2和图3

。

PBSμl为NFLX2OVA(220);3(220g/ml)。

NFLX2OVA的紫外扫描光谱

NFLX抗血清效价的测定　间接ELISA检测五免后的2只成年獭兔的抗血清效价结果见表1。

　　由表1可知,1号兔抗血清效价高,效价达1∶64000以

注:1为NFLX的PBS(18.6μg/ml);2为NFLX2BSA的PBS溶

液(220μg/ml);3为BSA的PBS溶液(220μg/ml)。

图2　免疫抗原NFLX2BSA的紫外扫描光谱

上,2号兔抗血清效价次之,效价达1∶32000以上。以P/N≥2.1,P/N>0.2的血清最高稀释倍数为该抗体的ELISA检测效价。其中,P为待测血清在某一稀释倍数测定的OD值;N为阴性对照血清在相应稀释倍数时测定的OD值。若1.5<P/N<2.1为可疑,则P/N≤1.5为阴性。ELISA效价是一相对效价,与包被浓度和反应条件相关,最终应以用

由图2可知,NFLX的PBS溶液的最大吸收峰在270nm处,BSA的PBS溶液最大吸收峰在278nm处,而免疫抗原NFLX2BSA与它们中任何一方的光谱都不同,其最大

　　表1

NFLX抗血

142.9002.4052.1631.7121.3310.6940.2760.050

22.7762.3032.0891.5471.2000.6880.2600.048

12.6182.1231.9121.3881.0610.6710.2580.051

0.52.5901.9851.8231.3781.0310.6660.2720.047

0.252.5271.93 …… 此处隐藏：5568字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……