植物学 RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展

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RNAi技术在植物功能 技术在植物功能 基因组学中的研究进展

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InterdactionRNA干涉 干涉(RNA interference,简称 简称RNAi) 干涉 简称 是指一些小的双链RNA(double strand RNA, 是指一些小的双链 dsRNA)可以高效 、 特异的阻断体内特定基 可以高效、 可以高效 因表达,促使 促使mRNA降解 诱使细胞表现出特定 降解,诱使细胞表现出特定 因表达 促使 降解 基因缺失的表型。 基因缺失的表型。 RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。 是一种高效的特异性强的基因阻断技术。 是一种高效的特异性强的基因阻断技术 可以快速分析靶基因的功能， 可以快速分析靶基因的功能 ， 近年来发展迅 速,已成为功能基因组研究和反向遗传学研究 已成为功能基因组研究和反向遗传学研究 的有力工具。 技术被《 的有力工具 。 RNAi技术被 《Science》 杂志 技术被 》 评为2002年度的十大科技突破。 年度的十大科技突破。 评为 年度的十大科技突破http://

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RNAi技术概述 技术概述 RNAi引起基因沉默的途径 引起基因沉默的途径 植物RNAi表达载体的构建 表达载体的构建 植物 RNAi技术在植物上的应用 技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望 存在问题与展望

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RNAi技术概述 技术概述1.1 RNAi的发现 的发现

1.2 RNAi的分子机制 的分子机制

1.3 RNAi作用的特点 作用的特点

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1.1 RNAi的发现 的发现1995年,康乃尔大学的Guo和Kempheus利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达以期 得到与对照组注射正义RNA (sense RNA)相反的结果，但结果却令 他们费解：二者同样阻断了par-1基因的表达途径。 1998年,Fire和Mello等首次将正义链和反义链的混合物注入秀丽新 小杆线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的 基因沉默(gene silencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。

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1.2 RNAi的分子机制 的分子机制外源性基因随机整合到宿主细 胞基因组内,产生一些dsRNA。 胞质中的核酸内切酶 核酸内切酶Dicer将这 核酸内切酶 些dsRNA切割成多个具有特定 长度和结构的短双链 短双链RNA(大约 短双链 大约 21~25 bp),即siRNA。 即 siRNA在RNA解旋酶的作用下 解链成正义链和反义链,然后反 义siRNA再与体内一些酶结合形 成RNA诱导的沉默复合物 诱导的沉默复合物 (RISC)。 RISC与外源性基因表达的 mRNA的同源区进行特异性结 合,RISC具有核酸酶的功能,在 结合部位切割mRNA, 被切割后 的断裂mRNA随即降解。http://

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RNAi信号的放大 信号的放大这是一种类似于RNA

聚 合酶的链式反应，该反应 以siRNA中的一条链为引 物，以靶mRNA为模板， 在RdRP作用下扩增靶 mRNA,产生新的二级 siRNAs(单链的具有明显极 性的反义RNA)。在Dicer酶 的作用下，这些二级 siRNAs又能反作用于靶 mRNA,使其降解，产生 更多的siRNAs。

siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶 RNA结合并在依赖 依赖RNA的RNA聚合酶 聚合酶(RNdependent RNA 依赖 的 聚合酶 polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA 再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放 大,最终将靶mRNA完全降解。 http:// LOGO

1.3 RNAi作用的特点 作用的特点高效性研究发现RNAi过程中不同浓度的dsRNA产生的效果一样。Miki等研究水 稻OsRac基因家族的功能时,通过构建单一基因片段的植物表达载体,成功地抑 制了OsRac基因家族的多个基因。说明RNAi可实现在一个个体或一个细胞内 同时沉默多个基因。

高度特异性由dsRNA诱导的RNAi只引起与dsRNA同源的mRNA降解,不影响其它基因 的表达,具有很高的特异性。 siRNA具有特征性的结构:5’末端为磷酸基,3’末端 为羟基,并且有2个突出的单链核苷酸。这种结构对RNAi是十分必要的。

ATP依赖性 依赖性研究发现,如果除去或降低内源性ATP含量,dsRNA对靶基因的抑制作用明 显降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加强。说明RNAi是一个对ATP 依赖的过程,且外源性ATP对此无促进作用。

可传播性在植物中,RNAi信号可以通过胞间连丝或维管组织在细胞间传递;而在动 物中,RNAi信号的扩散需要特殊蛋白参与,在膜上形成跨膜通道而传播到整个 机体。

可遗传性RNAi效应可以稳定的遗传给子代,在子代的表现型呈孟德尔遗传方式。 。http://

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RNAi技术概述 技术概述 RNAi引起基因沉默的途径 引起基因沉默的途径 植物RNAi表达载体的构建 表达载体的构建 植物 RNAi技术在植物上的应用 技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望 存在问题与展望

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转录后基因沉默( 转录后基因沉默(PTGS) )

转录水平基因沉默( 转录水平基因沉默(TGS) )

RNAi引起 RNAi引起 基因沉默 的途径

翻译水平上基因沉默 (miRNA) )

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转录后基因沉默( 转录后基因沉默(PTGS) )转录后基因沉默是最普遍的一种沉默机制。PTGS 通过降解mRNA来抑制基因的表达。包括几种现象:一种 现象是植物中的共抑制(co-suppress)现象,即引起外源 基因和靶基因或内源基因同时发生沉默,首次在矮牵牛 中发现此现象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也属于 共抑制现象。另一种是真菌发生静息现象(quellin

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转录水平基因沉默( 转录水平基因沉默(TGS) )它是由siRNA指导染色体发生变化(包括DNA和组蛋 白甲基化)是指启动子序列发生甲基化或局部染色体发 生变化,影响转录因子的结合,使基因不能正常转录,下调 基因表达。LOGO

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翻译水平上基因沉默这个过程主要是由内源性miRNA介导的一种基因 沉默。miRNA的前体(pre-miRNA)是70 nt的茎环RNA 或双链RNA,它们在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作 用下分裂成21~25 bp的成熟miRNA。成熟的miRNA是 具有约22 nt的5’为单磷酸基、3’为羟基的单链RNA。 22 nt 5’ 3’ RNA miRNA与相关蛋白质结合成另一种RISC复合体,RISC 复合体通过和靶mRNA结合,从而导致mRNA的降解或 抑制基因的转录。 植物miRNAs明显特征是剪切靶mRNA,如miR172, 主要功能是作为翻译抑制子。

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RNAi技术概述 技术概述 RNAi引起基因沉默的途径 引起基因沉默的途径 植物RNAi表达载体的构建 表达载体的构建 植物 RNAi技术在植物上的应用 技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望 存在问题与展望

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3 植物 植物RNAi表达载体的构建 表达载体的构建3.1转基因 转基因RNAi载体构建的关键因素 转基因 载体构建的关键因素在强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双 元载体是导致RNA沉默的基本结构。在该载体中 目标 沉默的基本结构。 元载体是导致 沉默的基本结构 在该载体中,目标 基因的cDNA片段被克隆在间隔序列 片段被克隆在间隔序列(spacer)的两端 这 的两端,这 基因的 片段被克隆在间隔序列 的两端 些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我 互补的hpRNA(分子内 分子内dsRNA)结构。 结构。 互补的 分子内 结构

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内含子有无在转录时通过拼接产生功能性间隔(spacer) …… 此处隐藏：3156字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……