噬菌体展示技术在HBV研究中的应用

噬菌体展示技术在乙肝中的应用

噬菌体展示技术在HBV研究中的应用

关亚娜 41109106

摘要：噬菌体抗体库技术和噬菌体肽库技术是噬菌体展示技术的两方面扩展，均可应用于HBV相关研究中，并取得一些进展，为HBV的侵染机制和相关疾病的预防诊断治疗都大有裨益。

关键字：噬菌体抗体库技术,噬菌体肽库技术

The application of phage display technology in the study of HBV Abstract:Phage antibody library technology and phage peptide library technology are the elongation of phage display technology, and both are applied in the study of Pathogenic mechanism, prevention, diagnose and therapy in HBV.

Key words:Phage antibody library technology; Phage peptide library technology

0 引言

乙型肝炎病毒感染是一个全球性健康问题[1]，我国是乙型肝炎高发区，约有1.2亿人为乙肝病毒携带者，占全球感染人数的1/3。生物高科技在病毒性肝炎的研究中起了极大的推动作用，噬菌体展示技术即为其一[2~5]。1985年美国Missouri大学Smith G P[6]等将外源基因插入丝状噬菌体f1的外壳蛋白基因Ⅲ中，获得的重组噬菌体可在体外稳定增生，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显

[7]。本文着重从噬菌体展示技术方面探讨其在乙型肝炎的研究、检测和治疗方面的应用。 1 噬菌体展示技术的基本原理

噬菌体展示技术是将多肽或者蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他衣壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与衣壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合，由此而组成含有多种短肽的库。该库与固相化的靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体及亲和力较弱的噬菌体，然后以竞争性受体或酸性洗脱剂洗脱与靶分子强力吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后，经繁殖扩增，再进行下一轮洗脱。经过3~ 5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集[8]。而后通过测序分析可以得到多肽基序而用于下一步的疫苗研究、诊断元件构建或其它目的[9,10]。

噬菌体展示技术采用经典的PCR 分子克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选106 ～ 108克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。目前人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。该技术的实质，是基因工程技术与亲和筛选技术的结合。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，它已经被应用于免疫学、细胞生物学及药物开发等领域，成为生物学后基因组时代一个强有力的实验技术。

2噬菌体展示技术在HBV研究中的应用

2.1噬菌体抗体库技术在HBV研究中的应用

噬菌体抗体库(phage antibody library)技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。将抗体的多样性可变区基因组装到噬菌体外壳蛋白基因，抗体基因编码的肽段与噬菌体壳蛋白融合后，就可得到以单链可变区片段(scFv)，或以抗原结合片段(Fab)的形式展示在噬菌体表面的噬菌体抗体库。将表达的抗体库经过“吸附-洗脱-富集”过程可从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。利用PCR获取抗体基因片段是该技术的一个关键，目前常

噬菌体展示技术在乙肝中的应用

用的抗体基因来源包括杂交瘤细胞，体外免疫细胞，B淋巴细胞等。

根据基因来源，噬菌体抗体库可分为免疫抗体库和非免疫抗体库。前者是采用经过免疫的淋巴细胞构建的抗体库。该库容量较小，且可以筛选到特异性较强的高亲和力抗体。非特异性免疫包括天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。天然抗体库是采用不经过免疫的淋巴细胞构建的抗体库，半合成抗体库是人工合成一部分可变区序列与另一部分天然序列组合构建的抗体库，而全合成抗体库是指抗体可变区序列全部由人工合成。非免疫抗体库的优点是抗体均来源于人类，是完全的人源化抗体，但亲和力通常较低，除非生成大量的抗体片段[10]。因此目前制备的非免疫抗体库容量已经普遍在1011数量级以上[11,12].

张志超等[13]从人源免疫抗体库中筛选到HBV的PreS1单链抗体，钟彦伟等[14]获得HBV核心抗原人源单链可变区抗体的编码基因及其表达。张爱华等[15]获得HBV表面抗原Fab抗体分子，袁玉峰等[16,17]获得人源抗肝癌单链抗体。从中可以看出，利用噬菌体抗体库技术，可以得到HBV全人源化的高亲和力的特异性抗体，用于HBV的诊断和治疗。

噬菌体抗体库研究的主要目的是生产用于疾病的治疗和诊断的单克隆抗体，应用噬菌体抗体库可以模拟天然抗体库，不需要免疫人和动物，适合大规模工业生产，以获取不同亲和力的抗体，因此，优化亲和筛选方法及筛选所用抗原等途径，研究出高亲和力大容量的抗体库，以及临床检验其治疗作用是该领域的热点。

2.2 噬菌体肽库技术应用与HBV的研究

噬菌体展示肽库是对噬菌体展示技术的另一个发展。噬菌体展示肽库主要以丝状噬菌体为载体进行的，丝状噬菌体包括M13、fd和f1，侵染F+大肠杆菌，基因组中由由gⅧ编码主要外壳蛋白，PⅧ和gⅢ编码次要外壳蛋白，PⅢ为常见融合位置。噬菌体展示技术就是通过将外源基因插入到丝状噬菌体编码外壳蛋白的gⅧ和gⅢ中而得到表达，表达的多肽可以融合蛋白的形式连接在PⅧ和PⅢ的N 端，在噬菌体表面独立展示其结构而不影响噬菌体的完整性和活性。但由于丝状噬菌体展示系统内在的限制不能展示细菌的毒性蛋白或多肽，1994年，Maruyama[18]等人将λ噬菌体尾丝蛋白PV 切开并将外源蛋白插入其中，从而将该蛋白展于λ噬菌体的外壳上。由于毒蛋白的合成在细胞的溶源状态下会受到抑制，在细胞裂解前很短一段时间才得以诱导，而且λ噬菌体展示肽不必经过蛋白分泌，而是在细胞内进行装配，随细胞裂解释放，因此λ噬菌体展示系统可以很好地解决毒性蛋白的展示问题。在研究过程中可根据所展示蛋白的不同而选用不同的噬菌体展示系统。

噬菌体展示肽库可用于抗原表位的分析。董菁等[19]发现在前—s1上游存在新的ORF，即前—前—S基因，黄燕萍等[20]利用噬菌体表面展示的人肝cDNA文库筛选到特异的HBV前—前—s基因启动子结合蛋白人类sMG—1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶（PIKK）等20种．杨艳杰等[21]利用噬菌体展示技术，从人肝细胞cDNA文库中筛选到HBV启动子I(SPI)结合蛋白4一氨基丁酸氨基转移酶等和SPⅡ的结合蛋白----尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4(NADHDH4)[22]。董菁、黄英等[23]筛选获得HBV表面抗原前-S1(PreS1)结合蛋白细胞色素等，刘霞等[24]获得PreS2结合蛋白细胞生长抑制蛋白42等。高学松、张忠诚等[25,26]获得HBV核心启动子结合蛋白β2微球蛋白等，钟彦伟等[27]获得HBV核心抗原结合蛋白，吴煜等[28]获得获得HBV X抗原基因启动子结合蛋白人血清白蛋白等，刘刚[29]获得HBV X蛋白相互作用蛋白C8B等。杨艳杰等[30]获得HBV增强子1的结合蛋白核膜孔复合体等，刘志英等[31]得到了肝癌血清蛋白结合蛋白。通过对筛选得到的蛋白的功能及与乙肝相关性的研究，可以对HBV的治病机制有更清楚的认识，以及应用与临床的诊断治疗 …… 此处隐藏：5160字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……