Cre_lox位点特异重组系统在植物基因工程中的应用

综述与专论

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

生物技术通报

2012年第5期

Cre/lox位点特异重组系统在植物基因工程中的应用

陈广东 崔继哲 付寅生 弭晓菊

（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨 150025）

摘 要： Cre/lox位点特异重组系统是植物基因工程中的重要工具，利用其可以在转基因植物中对目的基因实现精确删除和定点整合。概述Cre/lox系统的基本结构及作用方式，并以基因删除和定点整合为重点，详细介绍该系统在这两方面的应用。

关键词： Cre/lox 位点特异重组 删除 整合 转基因植物

Application of Cre/lox Site-specific Recombination System in Plant

Genetic Engineering

（College of Life Science and Technology，Harbin Normal University，Harbin 150025）

Abstract: Cre/lox site-specific recombination system is an important tool of plant genetic engineering, and can be applied in precise excision and site-specific integration of the interest gene in transgenic plants. This review focused on the basic structure, mode of action, and the application especial in gene excision and site-specific integration of the Cre/lox system.

Key words: Cre/lox Site-specific recombination Excision Integration Transgenic plant

Chen Guangdong Cui Jizhe Fu Yinsheng Mi Xiaoju

近年来，随着转基因技术研究的不断深入，位点特异重组技术在遗传工程的操作中得到了广泛应用。位点特异重组是由重组酶介导的重组反应，由重组酶和特异识别位点组成。与同源重组和转座作用相比，位点特异重组具有精确高效、方便改造、转化周期较短等优点，使其逐渐成为DNA操作中强有力的工具［1］。Cre/lox系统是目前研究最深入，应用最广泛的位点特异重组系统［2］。

个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区构成，每个反向重复及其邻近的4 bp构成一个Cre蛋白的结合区，链间的交换可发生在间隔区的6 bp之间［4］。

由于间隔区是非对称的，因此lox位点具有方向性。根据两个lox位点的方向不同，Cre/1ox位点特异重组系统在细胞内和离体系统中有以下3种作用方式［5］：当两个lox位点方向相同时，重组反应使lox位点之间的DNA片段被删除；当两个lox位点的方向相反时，重组反应使 lox位点之间的DNA片段倒位；如果两个lox位点不在同一分子上，将导致DNA发生易位。

1 C re/lox位点特异重组系统的结构及作用方式

Cre/lox位点特异重组系统于1981年在噬菌体P1中被首次发现［3］。该系统由Cre重组酶和lox位点组成，通过二者之间的相互作用实现重组。Cre重组酶属于整合酶家族，是噬菌体P1的Cre基因编码的分子量为38.5 kD的蛋白质，由343个氨基酸组成。野生型的lox位点被称为loxP，loxP位点是由两

2 Cre/lox重组系统在基因定点切除上的应用

2.1 删除选择标记基因

选择标记基因一直是转基因作物安全性中被关

注的焦点。得到转化体后，选择标记基因可通过共转化［6］、转座子系统［7］、位点特异性重组得以删除。

收稿日期: 2011-10-09

基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目（11551144）

作者简介:陈广东,男,硕士研究生,研究方向:植物分子生物学; E-mail: yy.chgd@http://www.77cn.com.cn

通讯作者:崔继哲,女,博士,教授,研究方向:植物抗逆分子生物学; E-mail: shiccc1@http://www.77cn.com.cn

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生物技术通报 Biotechnology Bulletin

2012年第5期

Dale和Ow［8］首先证明了Cre重组酶介导的删除反应能够成功应用于转基因植物中，删除标记基因。自从Dale等的先驱工作后，通过Cre/lox重组系统已成功获得许多物种的无标记转基因植物，表1列出了部分代表性成果 。

表1 通过Cre/lox

成功获得无标记的转基因植物

Kopertekh等［17］通过一个以马铃薯X病毒（PVX）为基础的载体，实现了Cre重组酶在转入了lox靶位点的烟草中的瞬时表达，重组表达的效率在

［18］

48%-82%之间。Kopertekh等利用农杆菌侵染法，

使Cre重组酶在转基因植株内瞬时表达。

第三种策略通常是用诱导型启动子（如热激诱导启动子或化学诱导启动子）使Cre重组酶在一定条件下表达。Khattri等［12］构建了两个载体，一个载体含有Cre基因和热激启动子Hsp17.5E；另一个载体，两个同向的lox位点之间带有选择标记基因npt，载体还带有一个无启动子的gus基因。用基因枪轰击盾片愈伤组织，从而使两个载体转入水稻中。热激胁迫诱导Cre/lox重组系统后，npt被删除，gus基因可以作为Cre/lox重组系统的便携的遗传标记。

但此方法有背景活性、低的重组效率以及转基因不能被完全删除等问题。为此，研究者们开始将，其组织特异型启动子应用于Cre/lox重组系统［19］优点是：高重组效率、不需要额外的步骤激活Cre重组酶、并且能更高效的将重组状态传给下代。Kopertekh等［9］通过共转化，将lox靶位点和Cre重组酶引入烟草中，依靠种子特异启动子的诱导，使bar基因表达盒从烟草基因组中全部删除。标记基因的删除没有干扰目的基因的表达。

目前主要有3种策略可将Cre重组酶的活性提供给含lox位点的目标植株，进而删除标记基因。第一种策略是利用Cre的组成型表达，对带有标记基因和lox位点的转基因植株进行再转化，使Cre表达载体转入其中，激活重组系统；也可以将带有标记基因和lox位点的转基因植株与能够表达Cre重组酶的植株进行杂交，激活重组系统。这种策略的优点是重组率高，缺点是耗费时间、操作繁琐，并且可能引起转基因植物中基因型和表型的改变。Dale等［8］就是利用此种方法首先证明了Cre重组酶介导的删除反应能够成功应用于转基因植物。2010年，Sengupta等［16］构建了含有ASAL（青叶蝉和褐飞虱抗性）编码序列的载体，此载体上含有两个方向相同的lox位点，lox位点之间带有选择标记基因hpt。同时，构建了另一个含有Cre重组酶基因的载体。转化后，将3株含有单拷贝ASAL-lox-hpt-lox T-DNA区的T0代植株与3株含有单拷贝Cre-bar T-DNA区的T0代植株进行杂交。通过潮霉素筛选试验表明，T1代中标记基因已经被删除。分析表明T1代植株有27.4%的重组效率。

第二种策略是Cre重组酶的瞬时表达，重组效率与第一种策略相当，但此方法需要额外的步骤引入重组酶和筛选重组的细胞，其主要应用于无性繁殖植物。目前主要通过含有Cre载体的病毒和根癌。农杆菌侵染植株，提供Cre重组酶瞬时表达［17, 18］

2.2 产生单拷贝转基因植株

遗传转化过程中，外源基因的多拷贝容易导致

基因失活，使转基因沉默，利用Cre/lox重组系统可以删除转基因中多余的拷贝。Srivastava等［20］首先创造性的使用Cre/lox重组系统，将有4个多拷贝位置的转基因小麦植株完全转变成为单拷贝。随后De Buck等［21］构建了含SB-loxP的T-DNA区，在两个方向相反的loxP位点之间引入了标记基因nptⅡ和gus基因。这样，无论插入的T-DNA区的数量和方向如何，发生在最外面的loxP位点之间的重组会将多余的拷贝删除，产生单一的T-DNA区拷贝。将带有多个SB-loxP序列的7个转基因植株与能产生Cre重组酶的植株进行杂交，有3个杂交后代是单拷贝插入的。但是，此种构建方法，即将两个方向相反的lox位点构建在一个T-DNA区上，容易使两个lox位点间的DNA片段倒转。De Paepe等［22］运用 …… 此处隐藏：11912字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……