聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

(一)管型盘状电泳 1.仪器和设备

图8 管型盘状电泳槽结构 A为正面 B为剖面

(1) 分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7

(3)电极缓冲液PH8.3

电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。 电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型，电压在0～600v内任意调节，电流输出0～100mA，这类电泳仪比较恰当。

玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径5～7mm左右，管长70～100mm。管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。

聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。

微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样，也可用50或100μl加液器代用。

普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，20～30ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。

其他：日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。

2.试剂 甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(VB2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。

丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

(1)丙烯酰胺纯化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，热滤，滤液凉后置-20℃冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。

(2)甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 40～50℃丙酮，加热过滤，滤液置-20℃冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。 3.试剂配制

(1)凝胶及缓冲液配制系统

有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。列表4供参考。最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。用时需测PH值，以检查是否失效。TEMED要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。

表4 几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统

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聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

(2)指示剂配制

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

蛋白质样品通常是无色的，为了观察和估计样品在凝胶上迁移情况，常加指示剂作为电泳迁移的可见标志。对碱性缓冲系统，一般用溴酚蓝或酚红，对于酸性缓冲系统，一般用甲基绿或次甲基兰。指示剂可直接加在样品中，也可加在电泳槽的缓冲液中，也可加在玻管中。 溴酚蓝通常配制成0.1%的母液备用。 (3)染色剂配制

蛋白质的染色方法很多，常用的染色剂有氨基黑10B，考马斯亮蓝R250，考马斯亮蓝G250等，有关配制浓度，染色方法以及同工酶的显色方法见操作过程中的染色部分。 4.操作技术 (1)凝胶制备

配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很多：在凝胶架的孔洞内，加少许40%蔗糖溶液，然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用1%琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝胶封住。

配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至室温下预温。

聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因为①有些样品会抑制胶聚合；②光照可引起某些蛋白质变性；③多了一道手续，延长制胶时间。 分离胶的制备：按表4比例混合贮存液，(先不与过硫酸铵混合)，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好标记，注胶到相同的高度。务必勿使气泡出现。为了使凝胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约3～5mm高度，消除凝胶的弯月面。加水要小心，切勿冲乱界面。加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。

水层放好后，静置30分钟，使凝胶进行化学聚合反应。聚合最适温度为25℃。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置20～30分钟，聚合便完全。

分离胶的预电泳(此步骤应根据实验的需要决定取舍)：凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品(如酶)会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳更为重要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。步骤：去除玻管封口，倒出玻管中凝胶上的水分，并用分离胶缓冲液洗涤一下。把玻管插入电泳装置中。上下电极槽中均加入分离胶缓冲液，预电泳的电流为3mA/管，时间需30分钟～2小时。预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

浓缩胶的制备：分离胶聚合好后，或已经过预电泳的分离胶，用注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余的水。按表4中比例混合浓缩胶液(也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，使用时再混匀)，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液1cm左右，各管加的高度应一致，并在上面加水层压平胶面。放在两只20W以上功率的日光灯下，约离灯管10～15cm处，光下聚合60分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。浓缩胶应临用前制备。 (2)样品的准备

聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。

盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管按体积，需要5～100μl的样品(约0.1～2mm高)；按含量需要5～100μg。实际上就是用0.1%浓度的样品5～100μl。由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品，通常用10～20μg，对于含有多种组分的样品，可用到200μg。即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于±5%。

近来，样品胶一般已改用样品液中加入5%～20%的蔗糖或10%甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。

如果样品离子强度太高，会引起分界面模糊不清 …… 此处隐藏：7842字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……