流式细胞仪检测细胞周期

9、采用流式细胞仪（FCM）研究MG63细胞周期 FCM检测细胞周期原理

流式细胞仪(flow cytometry或flow cytomyter，FCM)又称荧光活化细胞分拣器(fluorescence activated cell sorter，FACS)是20世纪60年代后期利用激光器和层流流动室而建立的一种用于测定放射性染色体的新技术。细胞周期(cell cycle)是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，包含G1期、S期、G2期、M期四个阶段(图1)。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。用FCM进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件(例如Becton Dickinson公司的Cell FIT)对其进行自动分析。此测定的细胞周期按照DNA的量分可为Go/G1期、S期及G2/M期。

FCM检测细胞周期流程①培养MG63细胞在 6 孔板内依次放入对照组和3 个实验组钛片各 40 片，接种密度为 4 × 105/ ml。培养至细胞汇合后，每孔加矿化液 2． 5 ml( 含 10 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β －甘油磷酸钠，50 μg/ml 抗坏血酸的培养液) 。分别培养 3、5、10、15 d 后，每组各取出 5 个钛片移至新的 6 孔板内，将钛片表面细胞消化离心收集。② PBS清洗经消化收集的细胞2～3次，调整细胞密度为1×106个/ml;③将细胞悬液100ul转移至试管中;④ 加入FITC标记的annexin V和PI溶液，轻轻混匀;⑤室温避光放置10～15min;⑥ 加入400ul缓冲液，将全部液体转移至FCM分析用试管;⑦ 尽快进行FCM分析（用FCM进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件(例如Becton Dickinson公司的Cell FIT)对其进行自动分析。此测定的细胞周期按照DNA的量分可为Go/G1期、S期及G2/M期）。并统计细胞周期各个时相所占比例和凋亡细胞百分比。