酵母单杂交手册(translated by mony)(3)

colony PCR (Section 11.B). After the clones have been sorted into groups, a representative of each unique type can then be analyzed for false positive interactions (Section 11.D).

酵母 单杂交 Y1HGold

11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离 请在开始实验前完整阅读本方法

表型确认的详细说明见方法A，酵母菌落PCR消除假阳性见方法B，能有效激活AUR1-C reporter的文库质粒的提取与分离见方法C，阳性互作和假阳性互作的区分见方法D。

下列推荐的方法可以帮助你确认真正的阳性互作，但是，请注意：your preferred order of events may be somewhat determined by the number of positives obtained from your assay. 比如，如果与你的bait sequence存在相互作用的蛋白在文库里是功能冗余的，你将会得到许多候选的阳性蛋白，需要你进行分类，它们中甚至很多可能是同一个蛋白，在这种情况下，在分离质粒前你可以通过进行菌落PCR实验(Section 11.B)消除因酵母繁殖造成的复制克隆。但是如果候选的阳性克隆很少，你就可以省略菌落PCR筛选步骤。 A. 方法：再划板确认报告表型

所需材料：

在SD/-Leu/AbA*培养基上筛选文库得到的单克隆菌落

（本实验将构建好的AD转到Y1HGold中，用SD/-Leu/AbA*培养基得到单克隆） SD/-Leu/AbA*培养基（见Appendix B） 方法：

1.挑取阳性克隆在SD/-Leu/AbA*培养基上再划板获得单克隆 (Appendix B)

2.真正的阳性克隆在30℃倒置培养2-4天后会再长出健康的单菌落，这些单菌落要进行扩大培养以进行随后的分析。

B． 方法：酵母菌落PCR消除假阳性（Duplicate Clones）

1.用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (Cat. No. 630497)扩增的你的文库插入片段（prey），这个试剂盒预先混合了酶，反应液（buffer）和引物，可以扩增出pGADT7载体上的cDNA插入。接下来你可通过第2-4步，用限制性内切酶酶切的方法排除假阳性。强烈推荐使用此试剂盒，因为在使用过程中方便可靠。

2.用0.8%TBE的琼脂糖凝胶电泳分析菌落PCR产物，扩增出多条条带属正常现象，因为一个细胞中可能包含多个prey质粒。

注意：为了确认大小相近的条带是否包含相同的插入片段，可用AluI、HaeIII或其他常用的内切酶酶切PCR产物，再用2%的琼脂糖凝胶分析产物（用浓度大的胶可以更好的分离片段）。 3.如果大多数的克隆里都包含一个大小相同的片段（AD/library insert），expand your PCR analysis to another batch of 50 colonies. 4.在此阶段，为了尽快的确认克隆片段，在照胶时只显示一条带的菌落可以用离心柱纯化（是否要挑菌提质粒？还是直接送菌液？或者直接切胶回收，回收产物即可用T7扩出来？），用T7引物确定序列（送测序，用通用引物T7）。

酵母 单杂交 Y1HGold

C． 方法：能有效激活的文库质粒的提取与分离 1.分离酵母文库中的质粒

转化后的酵母细胞体内可以同时存在多个不同的相关质粒（不用于转化后的E.coli细胞），这意味着在一个酵母细胞中，除开包含一个编码与bait序列相互作用的蛋白的prey质粒外，还可能包含其他没有相互作用的prey质粒。

如果你没有首先排除掉那些没有相互作用的prey，就采用转化E.coli来提取质粒的话，

那么你有可能得到并不存在相互作用的prey质粒。

为了增加提取到阳性质粒的可能性，建议在SD/-Leu/AbA*培养基上划板2-3次，每次都

挑取单菌落再划板，这样质粒就可以在这些克隆中分离出来（见第2步）。 2.从酵母细胞中分离出文库质粒

推荐使用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Cat. No. 630467)来提取SD/-Leu/AbA*培养基上长出的酵母细胞中的质粒，以便于确认是否为阳性互作。 3.提取到的质粒转化E.coli，分离文库prey质粒

因为pGADT7-Rec包含一段Amp抗性基因，所以prey质粒可以转化到任何E.coli菌株中，比如DH5α，并用含有100µg/mL Amp的LB板进行筛选。

D． 方法：区分阳性互作和假阳性互作

使用酵母单杂交筛选系统，有可能出现假阳性，因此，按照下列标准排除bait 序列和a prey 蛋白之间的假阳性互作就十分重要。 阳性互作（Genuine Positive）：激活AbAr报告基因要求同时存在Bait序列和Prey。 假阳性互作（False Positive）：prey和突变的bait序列一起激活AbAr报告基因。

图8. 说明报告基因表达模式在阳性互作和假阳性互作之间的差异

所需材料：

Yeastmaker Yeast Transformation System 2 reagents Y1HGold[Bait/AbAi] yeast

Y1HGold[Mutant/AbAi] yeast（暂时先不做，突变就要做结构域缺失） SD/-Leu培养基

SD/-Leu/AbA*培养基