酵母单杂交手册(translated by mony)

酵母 单杂交 Y1HGold

酵母单杂交手册 目录 1简介

2试剂盒包含的内容 3缩写

4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息 5附加材料&酵母培养基

A cDNA扩增、文库构建和筛选所需的附加材料 B 相应的培养基要求

6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建

A方法：合成、克隆p目的基因-AbAi质粒 B方法：构建诱饵-受体酵母菌株 7利用AbAr的表达检测诱饵菌株

A方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度 8 cDNA文库的构建

A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链

B方法：利用Long Distance PCR (LD-PCR)扩增cDNA第一链

C方法：利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns技术纯化合成的双链DNA 9单杂交的文库的构建和筛选

A方法：单杂交cDNA的文库的构建和筛选 10结果分析

11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离 A方法：通过划板确认受体表型

B方法：酵母菌落PCR以消除Duplicate Clones（假阳性克隆？多拷贝？） C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒 D方法：区分阳性克隆和假阳性克隆 E分析阳性克隆的序列 12问题排除指南 13参考文献

附录A：质粒信息

附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物 附录C：SMART技术原理

酵母 单杂交 Y1HGold

图表

图1 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用 图2 将相应的片段整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株 图3 利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库 图4 通过菌落PCR确认pBait-AbAi构建成功

图5 利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec 图6 利用SMART技术进行扩增

图7 利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物

图8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异 图9 通过共转化选择性培养基验证相互作用 图10 pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱 图11 pGADT7-Rec载体图谱 图12 pGADT7载体图谱 表格

表1 Y1HGold酵母菌株基因型

表2 利用各种SD培养基验证Y1HGold酵母菌株的表型 表3 AbAr本底表达的预期结果

表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系

表5 Matchmaker Gold One-Hybrid问题排除指南

表6 Set 1酵母培养基和Set 1 Plus酵母培养基的组分 表7 Matchmaker Gold Protocols所包含的每一个内容

酵母 单杂交 Y1HGold

1简介 A介绍

Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System为建立酵母单杂交cDNA文库的建立提供了一个简单高效的方法。Matchmaker Gold Systems具有AbA抗性因而具有很强的筛选能力，可极大地降低背景水平。这种单杂交方法是在酵母双杂交的方法上演变而来，可以识别和分析

蛋白质与DNA之间的相互作用，而不仅仅是证明蛋白之间的相互作用。（图1）

图1. 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用

将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold酵母基因组中以构建一个诱饵特异的报告

菌株。一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA抗性 (AbAr) 基因的表达。

酵母单杂交文库同时通过酵母细胞进行构建和筛选，以此得到活体内的重组质粒，使用这种方法无需通过大量繁琐步骤克隆、扩繁、获取大肠杆菌E.coli内构建的文库。Matchmaker Gold System方法中的文库构建用到了SMART cDNA合成技术，只需从任意组织部位提取总量为100ng 的RNA，即可使用该方法构建cDNA 文库。

B酵母单杂交的原理——蛋白-DNA互作的一种实验方法

诱饵（Bait）——DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或随即拷贝克隆到pAbAi载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株（图2）

酵母 单杂交 Y1HGold

图2. 通过同源重组将构建好的pBait-AbAi整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株。 ura3-52基因位于Y1HGold，常态下不活跃，造成不可逆的转座子中断现象，只有通过与野生型中的URA3 gene同源重组才可以修复。而pBait-AbAi载体就包含URA3 gene。当用BstBI 或 BbsI酶切表达载体后，pBait-AbAi载体呈线性化，用来转化Y1HGold，转化产物可以在SD/-Ura培养基（缺尿嘧啶）的培养基中生长，这些克隆中也包含稳定的Bait-AbAi，可以用来筛选蛋白-DNA之间的相互作用。

C猎物（Prey）在Matchmaker酵母单杂交方法里，可能结合DNA的蛋白，或者说猎物蛋白，被融合到含有酵母GAL4转录激活结构域（GAL4 AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMART PCR扩增的cDNA和线性化的pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建好酵母中的猎物文库（图3）

图3

利用SMART技术和酵母的生物学特性，在酵母中同时构建和筛选文库。 在酵母中同时构建和筛选cDNA文库。首先，利用SMART技术构建cDNA文库，这些cDNA文库的序列末端与线性化的猎物载体pGADT7-Rec

末端具有同源序列。将cDNA文库和pGADT7-Rec共转化到Y1HGold-Bait报告菌株中，在酵母中进行同源重组。将酵母细胞涂布于SD/-Leu/+AbA培养板上，以筛选表达报告基因的阳性的Y1H相互作用。

探寻蛋白-DNA的相互作用——Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度 (0.1-0.5 礸/ml) 下即可对

酵母产生毒性。包含AbAr gene（AUR1-C突变基因）的转化酵母菌株pBait-AbAi可以获得抗生素抗性。当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait），GAL4 AD就会激活 AbAr 的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长（图1）。

Matchmaker Gold One-hybrid技术可被用于： 鉴定新的蛋白-DNA的互作 验证已知或可疑的蛋白-DNA的互作

明确存在互作的蛋白结构域和同源的DNA序列

酵母 单杂交 Y1HGold

方法总述：（包含以下步骤）

第一步：将目的基因（bait）克隆到pAbAi载体上

第二步：将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold酵母菌株中（图2） 第三步：测试Y1HGold bait菌株的AbAr背景表达水平

第四步：通过共转化和体内同源重组构建和筛选cDNA文库（图3） 第五步：确认和解释筛选结果

ATTENTION: Successful use of any yeast one-hybrid system depends upon no/low recognition of your target sequence by endogenous yeast transcription factors, which can cause high background expression of the reporter gene. For this reason it is critical to test your Y1HGold [Bait-AbAi] strain for AbAr expression (AbA resistance) before screening a library (see Section 6).

注意！酵母单杂交系统是否可靠取决于内源酵母转录因子不识别/几乎不识别你的目的片段，如果能识别该目的片段将造成报告基因很高的背景表达。因此，在进行文库筛选前要严格测试酵母菌株Y1HGold [Bait-AbAi] AbAr的表达（可产生AbA抗性）

酵母 单杂交 Y1HGold

2试剂盒包含的内容

The Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System (Cat. No. 630491)包含的材料可以构建5个酵母单杂交文库，推荐使用Advantage® 2 PCR Kit (Cat. Nos. 639206 & 639207) 试剂盒扩增SMART cDNA来获得双链DNA（ds cDNA）

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3 缩写

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