酵母单杂交手册(translated by mony)(2)

SD/-Ura/AbA* 培养基。若prey proteins与bait sequence之间存在相互作用，就会产生Aureobasidin A抗性，用于筛选的AbA的浓度要根据每个酵母菌株的不同采用滴定法进行确定。

酵母 单杂交 Y1HGold

6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建 在开始实验前请仔细阅读该说明书，克隆目标基因详见方法A。获得Y1hgold target reporter bait strain详见方法B。

A．方法：构建pBait-AbAi 质粒

pBait-AbAi质粒必须包含至少一个目的DNA拷贝，插入到pAbAi 载体AbAr受体基因的上游，(具体说明见 Target Sequence Notes)。许多研究表明高效的质粒包含三个目的基因的串联拷贝，但是在有些情况下单拷贝也能满足条件。有多种方法可以获得串联拷贝，其中利用寡核苷酸合成（引物合成）是最为方面可靠的办法，尤其是合成<20 bp的常规片段。

（设计引物时两端酶切位点应不同

mutant bait 载体作为负对照，方法见Section 10

若有已知的与目的序列互作的蛋白，可将其整合到pGADT7 vector作为正对照）

1. 针对不同的目的DNA序列，设计两个反向平行的引物，该引物对必须包含pAbAi载体上的酶切位点，

以产生粘性末端。强烈建议当5’-end选择MCS中SmaI上游的多克隆位点做为酶切位点时（比如SacI），3’-end选择SalI或XhoI作为酶切位点。建议同时构建一个mutant bait 载体，这个载体包含一段可以抑制bait结合文库蛋白的目的DNA序列（RNAi？）

2. 合成的引物在PCR程序过程中，退火之后，引物可以结合到pAbAi载体上。

引物在–20°C保存。

a.溶解引物至终浓度为100 µ M的母液

b.按照1：1比例混合上游引物和下游引物，至终浓度为50 µM （假设100% theoretical annealing) c.将混合后的溶液在95°C处理30s，使所有二级结构解聚 d. 72°C 加热 2 min e. 37°C 加热 2 min f. 25°C 加热 2 min g.置于冰上

3. 线性化1 ug pAbAi载体。用限制性内切酶酶切pAbAi载体，使其带有粘性末端（详见Section 6 A.1）。跑琼脂糖凝胶电泳，分离线性化的载体，再切胶回收纯化该片段。 4. 连接线性化的pAbAi Vector和ds oligonucleotide

a.将（2g.冰上保存的）引物浓度稀释到0.5 µ M

注意：为了达到较高的连接效率，引物一定要进行稀释，若引物浓度太高会降低连接效率。 b.反应体系：（按照相应比例换成10uL体系）

酵母 单杂交 Y1HGold

注意：如想做对照，可用1uL ddH2O替代目的片段

Note: If desired, a control ligation can be assembled using 1 μl of nuclease-free H2O instead of annealed oligonucleotide.

c.反应混合液置于室温3h，转化大肠杆菌E. coli，菌落PCR鉴定阳性菌落，挑阳性菌落，摇菌扩繁，提质粒，酶切鉴定载体是否构建成功。

B. 方法：获得Bait-Reporter Yeast Strains

将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold菌株中包含以下步骤（示意图见Figure 2）：

第一步：用限制性内切酶BstBI 或 BbsI酶切pBait-AbAi， pMutant-AbAi（阴性对照，确定有相互作用后再构建）， 和 p53-AbAi（阳性对照，一定与AD存在互作）质粒，使其线性化。

第二步：将线性化的质粒转入Y1HGold菌株，用SD/-Ura培养基进行筛选。

第三步：菌落PCR鉴定阳性菌落，消除假阳性。pMutant-AbAi和p53-AbAi如何鉴定？Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)？

第四步：摸索确定抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度。

强烈建议按照以下方法将线性化的p53-AbAi转入酵母做为阳性对照（正对照），构建pMutant-AbAi作为阴性对照（负对照）。

所需材料：

Y1HGold yeast strain

p53-AbAi质粒以及根据方法A构建的pBait-AbAi质粒和pMutant-AbAi 质粒 限制性内切酶BstBI 或 BbsI

去DNA试剂盒 DNA clean-up kit (e.g. NucleoSpin Extract II, Cat. No. 740609.50) Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (included) Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)

SD base+ DO Supplement-Ura 固体培养基（SD/-Ura with Agar） YPDA液体培养基（可采用YPD代替YPDA）

1. 用限制性内切酶 BstBI或BbsI同时酶切2ug pBait-AbAi，pMutant-AbAi和 p53-AbAi，将载体

上的URA3基因打断，载体线性化。酶切后，电泳分离片段，切下目的片段，用试剂盒回收纯化。可用NucleoSpin Extract II (Cat. No. 740609.50)试剂盒，本实验室用普通胶回收试剂盒。 2. 用Yeastmaker Yeast Transformation System 2（PT1172-1）里面提到的方法，将线性化的1ug

质粒转到Y1HGold中

将转化后的菌液分别稀释10倍，100倍，1000倍，吸取100 uL稀释后菌液到

SD/-Ura固体培养基上。

4. 培养三天后，挑取5个单菌落，用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1做菌

落PCR，确定阳性菌落（原理见图4）。用未转化的Y1HGold菌株做负对照。

3.

酵母 单杂交 Y1HGold

图4.用菌落PCR验证pBait-AbAi整合到Y1HGold中。Matchmaker Insert Check PCR Mix 1中的引物位于Y1HGold基因组中的AbA 基因上，处于URA3基因的下游。如果质粒成功整合到Y1HGold中，利用这对引物可以扩增出一段包含bait序列的约1.4kb+X的片段。联系图2更便于理解。 预期的PCR结果分析： 正对照：1.4kb 负对照：没有条带

包含目的片段的菌株：1.35 kb + Insert size（1.5kb）

5. 确认为阳性菌株的各挑一个单菌落，以及正对照 p53-AbAi control上的一个菌落，挑菌在

SD/-Ura培养基上划线，30℃倒置培养平板

r

3天，在4℃至少保存1个月，既构建好

Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi] control strain。

6. 挑菌在YPDA (3 ml)液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，加1mL freezing medium (Appendix

B)重悬菌体。在液氮中速冻后，可在–70℃长期保存。

注意：完整的质粒是非常稳定的，即使在没有URA3选择压力的液体培养基上过夜培养，也不会导致质粒部分结构丢失。

酵母 单杂交 Y1HGold

7.利用AbA的表达检测诱饵菌株

r

A. 方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度

如果bait sequence整合到pAbAi载体中，在没有猎物蛋白（prey）的诱饵报告菌株（bait reporter stain）中的本底表达水平是不稳定的。例如，抑制p53-AbAi control生长的的最低Aureobasidin A浓度是100 ng/ml。

注意：任何酵母单杂交实验成功的关键取决于酵母内源转录因子对你的目的片段不识别/几乎不识别。因此，在筛选文库（或验证相互作用）前要用AbAr expression严格测试构建好的诱饵菌株。以下的实验方法

可以帮你确定在文库筛选过程中抑制bait construct本底表达的AbA浓度。

所需材料：

利用第6部分B方法得到的Y1HGold[Bait/AbAi] strain，Y1H[Mutant/AbAi] strain和Y1HGold[p53/AbAi] control strain SD/-Ura培养基 Aureobasidin A (AbA)

包含100–200 ng/ml AbA的SD/-Ura/AbA培养基 方法：

1. 从bait和control strains中挑选较大的菌落，用适量0.9% NaCl重悬菌液，调至OD600~0.002（即大

约每100uL包含2000个细胞）

2. 分别在SD/-Ura，SD/-Ura with AbA (100 ng/ml)，SD/-Ura with AbA …… 此处隐藏：3740字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……