内质网内的泛素化机制(2)

但是那些需要更多帮助才能成熟的蛋白质又是如何获得正确构象的呢？作为哺乳动物细胞内质网内最主要的折叠装置，UDP葡萄糖（UDP-glucose）糖蛋白葡萄糖基转移酶（glycoprotein glucosyltransferase，GT或者叫UGGT）能识别出非天然蛋白质，并使其聚糖分子A分支重新葡萄糖基化，这样，就可以再次与钙联接蛋白或钙网织蛋白相连，进行重新折叠（图4b）。这种钙联接蛋白-钙网织蛋白循环

（calnexin–calreticulin cycle）只是哺乳动物细胞内蛋白质质控系统里的第一步，但是如果新生蛋白―错过‖了这一轮成熟的机会，就只能被降解掉。

关于内质网的泛素化机制

图4 在酵母细胞和哺乳动物细胞内质网中对N连接聚糖分子的处理过程示意图。a：在酵母细胞和哺乳动物细胞中，寡糖基转移酶（oligosaccharyltransferase，OST）能将多萜醇载体上的葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子

（glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide）转移到底物蛋白Asn-X-Ser/Thr基序中的天门冬酰胺残基上。在酵母细胞中葡萄糖苷酶1、2（glucosidases 1 and 2，Gls1、Gls2）能将葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子中最外侧的两个葡萄糖残基去除掉，形成葡萄糖1-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（glucose1-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），如图中步骤1所示。在Gls2蛋白的继续作用下最终能形成甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子

（mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），该分子能保护糖蛋白免遭降解，见步骤2。Mns1蛋白能去除聚糖分子B链，即中间链上最外侧的甘露糖残基，形成甘露糖8-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose8-N-acetylglucosamine2

oligosaccharide），这说明该糖蛋白在内质网中停留了很长的一段时间，见步骤3。然后，Htm1蛋白继续处理最右手边的C链糖蛋白，形成甘露糖7-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose7-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），见步骤4；b：在哺乳动物细胞中，步骤1和2与酵母细胞中发生的相同，只不过在步骤2中由葡萄糖苷酶II（glucosidase-II）完成的去除A链中最后一个葡萄糖残基位点的反应是可逆的。葡萄糖基转移酶（Glucosyltransferase，GT）能促使那些未能获得天然构象的糖蛋白再次发生葡萄糖基化，见步骤3。如果EDEM蛋白被ERManI进行过度的去甘露糖基化处理或者被内质网降解，都会形成甘露糖5-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子（mannose5-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide），而这就是蛋白质应该被降解的信号，见步骤4。

2. 给予降解信号

那些没能获得天然构象的蛋白质必须被细胞降解，以免进行不必要的折叠，以免内质网被这些蛋白占据。―甘露糖计时器（mannose timer）‖模型认为，一旦蛋白质上的甘露糖残基被去掉，那么它就无法再获得正确的构象了。实际上，内质网中的糖基水解酶47（glycosylhydrolase-47，GH47）家族蛋白才是体内处理错误蛋白的第一道防线。在酵母细胞中，GH47家族里有两名成员在内质网中被发现，它们分别是α1,2甘露糖苷酶（α1,2-mannosidase）Mns1（该蛋白也被称为甘露糖苷酶样蛋白1）和甘露糖苷酶样蛋白Htm1，该蛋白是甘露糖苷酶1（mannosidase 1）的同系物。Mns1蛋白能去除N连接聚糖B链上最外侧的甘露糖残基（图4）。实际上，这种修剪作用能影响到内质网中的所有糖蛋白，但是对糖蛋白的成熟过程和酵母细胞的存活都不会造成任何影响。不过如果细胞缺失了MNS1基因，那么对错误蛋白的处理能力就会被削弱，

关于内质网的泛素化机制

这说明在Mns1蛋白催化甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖(mannose9-N-acetylglucosamine2 glycan)转变为甘露糖8-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（mannose8-N-acetylglucosamine2 glycan）之前，糖蛋白一直都被保护起来而免遭降解。

因为Mns1蛋白是不考虑蛋白的折叠状态，对所有蛋白―一视同仁‖的，由此可见，仅仅只靠8甘露糖结构是不足以促使糖蛋白降解的，一定还有其他的信号机制帮助细胞区分正常的蛋白与异常的蛋白。我们最开始认为Htm1蛋白只是一种凝集素蛋白（lectin）。但现在我们认为，糖蛋白在经过Mns1蛋白处理之后，Htm1蛋白可以去除掉N连接聚糖C链上的α1,2甘露糖帽结构（capping α1,2-mannose），不过我们目前还缺乏这方面的直接证据。因此，Mns1蛋白和Htm1蛋白之间的这种序贯作用最终就形成了甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2结构（mannose7-N-acetylglucosamine2），这种结构就是被ERAD所识别的信号。上述这种理论也可以解释为什么细胞缺失了编码α1,3甘露糖转移酶（α1,3-mannosyltransferase，Alg3）的基因之后细胞就可以在不需要Htm1蛋白的情况下仍然能对糖蛋白进行降解了。我们在Δalg3细胞中发现，在N连接聚糖糖蛋白上有甘露糖5-N-乙酰葡糖胺酶2结构（mannose5-N-acetylglucosamine2）结构，该结构的末端仍然连接有由Htm1蛋白导致的α1,6甘露糖残基。Htm1蛋白是如何选择底物的我们还不清楚。不过Htm1蛋白可以和二硫化物异构酶（disulphide isomerase）Pdi1蛋白一起形成复合体，因此，Htm1蛋白可能只能对与氧化还原酶（oxidoreductase）有关的Pdi1蛋白的底物发挥作用。

在哺乳动物细胞中，我们在内质网中发现了GH47家族蛋白中的四名成员，即内质网α1,2甘露糖苷酶1（ER α1,2-mannosidase-I，ERManI）和其他三个甘露糖苷酶样蛋白EDEM1、EDEM2、EDEM3。ERManI蛋白与它在酵母细胞中的同源蛋白一样，也能水解α1,2甘露糖苷键，切掉B链上的一个甘露糖残基。内质网中ERManI蛋白的丰度能影响ERAD系统底物的稳定性。如果使用siRNA技术敲除掉ERManI蛋白，就会影响未被切割的无唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor）H2a蛋白前体的降解过程。如果过表达ERManI蛋白，则会增强去甘露糖基化作用（de-mannosylation），降解掉α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin）的无效变异体蛋白（null Hongkong (NHK) variant）。

不过在酵母细胞中，仅靠ERManI蛋白还不足以对糖蛋白进行标记，使其降解。似乎ERManI蛋白还需要与EDEM家族蛋白共同作用才能处理掉异常的糖蛋白。虽然我们过去认为EDEM蛋白只是凝集素而已，但是现在已经年有证据表明EDEM家族蛋白与Htm1蛋白一样，都是甘露糖苷酶。细胞内EDEM1和EDEM3蛋白过表达时，连接在底物蛋白，诸如NHK、BACE451、T细胞受体α亚单位上的葡聚糖分子中甘露糖残基的数量就会减少。此外，根据我们对EDEM蛋白结构模型的分析，我们发现EDEM蛋白与ERManI蛋白在结构上具有惊人的相似性，而且还发现对于ERManI蛋白催化活性比较重要的氨基酸残基都非常保守。这说明至少EDEM1和EDEM3蛋白具有甘露糖苷酶的活性。不过我们还不清楚这些酶是如何选择各自底物的。但是我们知道EDEM1蛋白能与钙联接蛋白发生相互作用，因此，它可能借此方式来与底物糖蛋白发生相互作用。

3. ERAD系统的分类整理功能

被内质网内甘露糖苷酶I蛋白和Htm1蛋白处理过的折叠错误的糖蛋白最终必须由泛素连接酶进行泛素化修饰。但是未经糖基化修饰的异常蛋白也会经由上述途径进行降解，不过我们现在对起始过程还不清楚。背景知识2中对ERAD系统的主要底物进行了归纳总结。在蛋白的内质网腔、跨膜区域和胞质结构域里可

关于内质网的泛素化机制

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