蛋白质糖基化的研究进展_王家红(2)

O-糖基化位点的标记多采用化学法,其中报道较多的是B-消除反应法。该方法基于在碱性环境中Ser、Thr的O-糖基团会发生B消除形成一个不饱和的双键,这个双键可以被亲核试剂攻击发生加成反应,使Ser或Thr残基的质量相对其理论质量发生一个特定的变化,也就是使O-糖基化位点被质量标记。而且这种质量标记在PSD或CID的条件下是稳定的,从而可以通过串联质谱测序的方法得到糖基化位点的信息。该方法很早就被广泛应用,方法也在不断改进,不足之处在于非糖基化或磷酸化的Ser、Thr残基的侧链羟基也可能发生B-消除,这是该类方法在应用中应当注意的问题。

314 三氟甲基磺酸(trifluoromethananesulphonicacid,

TFMS)法

该法可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基,留下的糖基则起到标记糖基化位点的作用。此方法反应温和,速度较快且可以作用于所有类型的糖链。作为一种广谱、高效温和的方法,TFMS法用于糖蛋白组学的前景还是很诱人的。只是该法在操作时要保持严格的无水条件,且糖链末端唾液酸的存在会影响反应效率。4 糖蛋白糖链结构分析

蛋白质的糖基化分析除了包括确定糖基化位点在那个氨基酸残基以外,对于糖链结构的分析同样非常重要。目:

411 质谱法

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经典质谱分析技术通常采用酶法或者化学的方法把糖链与肽链分开,再分别在氨基酸序列水平或者糖链水平进行进一步的分析。有研究采用膜上样品直接质谱分析技术,这种技术需要的样品量极小,因此1个2-D胶上的蛋白质点可以被分为若干份进行处理,一部分用蛋白酶进行酶解,用于蛋白质的鉴定,另一部分用糖苷酶进行酶解,用于寡糖链结构的研究,再将这两部分结合起来,就可以得到糖肽的信息。Kimura等[8]将这项技术用于血浆糖蛋白组学的研究,选择了7个蛋白质点进行分析,7个蛋白质均成功鉴定,并成功分析了其中3个蛋白质的糖链信息。电喷雾质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)因其独特的/软电离0方式,可较好地对高极性、难挥发、热不稳定的糖等生物大分子进行结构分析而被称为生物质谱。近年来,在线分析技术的发展使得联机技术和串联质谱技术(MSn)日趋完善。联机技术,如GC/MS、HPLCP/MS、CE/MS和Chip/MS等不需经过过多的分离纯化步骤直接将微量样品上样分析,可更加有效地获得相关的糖链结构信息。其中Chip/MS技术是新近开发的能够微量、快速、高通量测定糖链结构的良好工具。Froesch等[9]利用全自动芯片电喷雾和傅里叶转换离子回旋共振(FTICR)质谱相结合进行了高效的糖筛选和测序研究。

412 核磁共振法(NMR)

目前,NMR技术已成为糖链立体化学结构分析最重要的方法之一,可确定糖链的构型、连接位置、分支和微观多样性[10]。Kogelberg等[11]从人乳中分离出一种未果糖型和3种不同果糖型的寡糖。通过ES-MS和NMR的结合使用确定其结构特点,通过ES-MS/MS分析阐明其分支类型、血型相关刘易斯决定簇、部分序列和寡糖链连接情况,最后通过甲基化分析和1H-NMR确定其全序列。最终鉴定出三种新的糖链结构:未果糖结构,单果糖结构和三果糖结构。但NMR测定糖的讯号峰重叠严重,解析较难,灵敏度不高,而且多维NMR需要毫克级样品,这对多数糖复合物中的微量糖链是很难达到的。413 芯片技术

以糖芯片和凝集素芯片为代表的亲合芯片技术可利用糖链与凝集素之间的特异识别和结合能力间接给出糖链的相关结构信息,是目前高通量快速分析蛋白质糖基化类型的良好工具。Zheng等[12]将由不同凝集素构建的凝集素芯片放入六孔板中,观察了所培养细胞表面上糖链的表达情况。该法简单易行,通过显微镜就可获得结果。414 糖结构分析软件

糖蛋白质量数的分散及糖本身的性质决定了质谱分析的灵敏度较低,经过糖蛋白/糖肽的纯化或糖链的衍生化,等,可以一提高质

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药物生物技术第18卷第1期

测的灵敏度,但后续的糖蛋白结构分析仍然有很多困难,由于糖链的微观不均一性,一个糖基化位点上的糖链类型就可能多达几十种,虽然高分辨的质谱可以成功的检测到这些不同的糖型(glycoform),但质谱图相对也很复杂,这些质谱图能否有效的处理及分析直接决定了糖结构分析成功与否。在研究者们的努力下,近几年也有了比较好的进展,已经出现了相对成熟的软件,如StrOligoAlgorithm算法,可以分3步自动处理糖肽的串联质谱图。5 展 望

蛋白质糖基化是沟通蛋白质和糖这二大类生物大分子的桥梁。在蛋白质组学水平进行蛋白质糖基化研究有助于全面深刻地认识蛋白质糖基化发生、发展的规律及其在整个生命过程中的生物学意义,有助于从基因组-蛋白组-糖组这样一个宏观的综合的层面上观察分析生命现象,达到对生命现象更本质的认识,进而有助于发病机制的阐明,为疾病的早期诊断、治疗等提供更科学的指导。另一方面,当前的蛋白质组学研究热潮也为糖生物学研究的发展提供了千载难逢的机会。作为一类重要的信息中介分子,糖只有与其他诸如蛋白质、脂类的糖基化等放在一起研究才更接近其本质含义。相信随着蛋白质糖基化分析技术的不断发展与完善,作为蛋白质修饰谱研究重要组成部分的蛋白质糖基化研究必将在加深对蛋白质生物功能多样性认识的同时,极大地拓展对于糖类的生物学功能的认识。

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cellsurfacecarbohydrateexpressi …… 此处隐藏：3033字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……