蛋白质糖基化的研究进展_王家红

药 物 生 物 技 术

PharmaceuticalBiotechnology 2011,18(1):077~080

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蛋白质糖基化的研究进展

王家红,童 玥,朱 玥,田 浤,高向东

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(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009)

摘 要 作为一种普遍存在的翻译后修饰,糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响,弄清糖基化发生发展的规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。文章就糖基化对蛋白质结构的影响、对治疗性蛋白的药理学意义、糖基化位点分析及糖链分析方法作了简要介绍。

关键词 糖基化;蛋白质结构;药理学意义;糖基化位点;糖链分析

中图分类号 Q51 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2011)01-077-04

蛋白质糖基化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,蛋白质功能的实现多与糖基化修饰密切相关。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用,并参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程[1]。蛋白质的糖基化,特别是N-连接糖基化普遍发生在细胞外环境的蛋白质中,包括膜蛋白、分泌蛋白和体液中蛋白,而这些恰巧都是容易获得并易于用作诊断和治疗的对象,因此,许多临床的生物标志物及治疗的靶标常是糖蛋白。系统定性定量分析糖蛋白及其方法学的发展对于发现新的疾病诊断标志物及治疗靶标都有非常重要的意义。糖生物学研究也正在成为继核酸、蛋白质之后生命科学中又一极具潜力的研究领域。本文将从糖基化对蛋白质结构的影响以及糖基化对治疗性蛋白的药理学意义、糖基化位点分析、糖链结构分析等方面进行综述。

1 糖基化对蛋白质结构的影响111 影响蛋白质的折叠

具有一定氨基酸排列顺序的多肽链需要进一步折叠形成一定空间结构的蛋白质分子,才能发挥生物学功能。在蛋白质折叠的过程中,糖蛋白的糖基化起到关键作用。Nakajima等[2]报道N-糖基化对于UGT1A9蛋白(一种UDP葡萄糖苷酸转移酶)的正确折叠有重要影响。UGT1A9蛋白在71、292、344位3个位点都是糖基化的,但糖基化的程度或者聚糖的大小不同。将上述3个位点的天冬酰胺突变为谷氨酰胺后,这些突变体与野生型相比酶活性均降低。为了评估糖基化对于蛋白质的作用,通过将衣霉素表达质粒短暂转染HEK293细胞得到未糖基化的UGT1A9,未糖基化的UGT1A9几乎没有活性。但是,在非变性条件下用内切酶H(EndoH)处理得到去糖基化的

UGT1A9,却显示出和野生型相同的酶活力,说明聚糖本身对于酶活性并没有决定性影响。通过免疫印迹分析发现如果没有正确的N-糖基化会严重影响蛋白质的正确折叠,从而影响酶活力。通过热力学稳定性证实在翻译过程中形成的糖基化对于UGT1A9的折叠非常重要。112 影响蛋白质构象的稳定

除了帮助蛋白质正确折叠外,糖基化还可以增加蛋白质的稳定性,这一点在对SH3蛋白质的研究中得到证明。SH3结构域最初是在Src(一种致癌基因)中鉴定到的由50个氨基酸组成的组件,能够识别富含脯氨酸和疏水残基的特异序列的蛋白质并与之结合,从而介导蛋白与蛋白相互作用。Bechor等[3]在不影响蛋白质结构的条件下,在SH3蛋白质的/天线0和/线圈0结构上选择6个糖基化位点进行糖基化,通过计算机模拟得到了63个糖基化的结构,并通过蛋白质数据库来分析所有突变体的结构。

在热力学研究中,比热容图中曲线的峰(Tf)表示蛋白质的折叠温度。研究显示每增加一个糖基,蛋白质的热力学稳定增加016~019e,说明蛋白质的稳定性随着糖基化程度的增加而增加,而结合一个大的右旋糖酐的突变体与结合一个小的乳糖的突变体有近似的热力学稳定性,所以,结合在蛋白质上的糖基的数量决定了稳定的程度,而糖基的长度影响较小。从动力学研究方面,测定无糖基化的SH3和所有糖基化的突变体在Tf时的非折叠态的自由能阈发现,与没有糖基化的蛋白质相比,每增加一个糖基能阈增加319%。说明糖基化同样能增加蛋白质的动力学稳定性,而结合大的糖基和小的糖基的突变体有着相似的稳定性。由此说明,糖链的引入能够增加蛋白的结构稳定性,并且这种稳定性与糖基的数量成正比,受糖链大小影响较小。

*收稿日期:2010-05-18 修回日期:2010-06-18作者简介:王家红,1981年生,山东沂水人,在读硕士研究生。

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2 糖基化对于治疗性蛋白的药理学意义

药物生物技术第18卷第1期

抗体Fc片段的糖基化对于FcC受体介导的活性至关重要。糖的不均一性尤其是岩藻糖基化或者二等分N-乙酰葡萄糖胺的存在能够调节血液中效应细胞的活性,并通过调节抗体的活性来影响NK细胞介导的杀伤作用。Peipp等发现岩藻糖的缺失并没有增加治疗性抗体的所谓抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。研究表明Fc片段的岩藻糖基化对于ADCC的影响取决于效应细胞的类型。岩藻糖含量低的抗体能增强单核效应细胞的ADCC,而岩藻糖含量高的抗体更倾向于招募多形核白细胞。没有岩藻糖基化的抗CD20能够通过增强与吞噬复合受体FcCRÓb的结合来加强中性粒细胞的吞噬作用。非岩藻糖基化的利妥昔单抗就是通过激活人中性粒细胞的功能来增强癌症病人的免疫应答以达到治疗的目的。214 药代动力学

糖基的种类对于治疗性糖蛋白的药代动力学特性影响深重。来那西普(Lenercept)是由人IgG1的Fc段和两个肿瘤坏死因子的结合区域组成的免疫黏附素,是由CHO细胞制造而来。来那西普含有大量的N-糖基化,而没有高-甘露糖型聚糖。在临床试验中发现不同批次生产的来那西普所测定药代动力学参数存在差异,Rodney等测定了不同批次来那西普的各部分结构,首先排除了由蛋白部分的结构改变带来的变异性。进一步研究发现,影响药代动力学参数的因素就在于该糖蛋白末端的N-乙酰葡糖胺。糖蛋白在体内的清除依赖于能识别其中寡糖结构的特殊受体,清除含有N-乙酰葡糖胺的受体和甘露糖受体比较类似。正是由于N-乙酰葡糖胺在批次间的差异导致了药代动力学测定结果的不同。糖基化作用使得药用蛋白的生产过程更加复杂,这提示人们在生产象来那西普这样的药物时应建立关键性质控指标,如此处的N-乙酰葡糖胺的测定方法及标准。215 免疫原性

病人对于治疗性蛋白的免疫反应,特别是在一些慢性适应症中,对药物安全和有效性有非常大的负性影响,因为它能产生一种中性抗体,少数情况下,还可能引起超敏反应。通常,糖基化可以掩护在大肠杆菌或其它表达系统中产生的重组产物的暴露表位,N-连接和O-连接的寡糖的末端唾液酸残基对于掩护抗原决定簇和表位是非常重要的,抵抗一种治疗性蛋白的抗体的产生很可能与唾液酸酰化有关联,带负电的唾液酸能够影响蛋白特定的常数比如热力学稳定性、对蛋白酶降解作用的抵抗力和溶解性。3 糖基化位点分析方法

鉴于糖基化对于蛋白质结构和功能的重要影响,糖基化的分析方法也越来越受到重视。质谱已成为蛋白质组中最重要的技术之一,同时也是分析糖蛋白应用最广泛的技点分析,质其独特糖基化对于治疗性蛋白具有非常重要的药理学意义,目前,有超过20种重组抗体被批准用于各种癌症和慢性疾病的治疗,尽管IgG-Fc的糖基化只占抗体分子质量的2%~3%,IgG-Fc的糖基化对于下游区的生物机制非常重要(效应功能),而且结合的寡糖能精确影响其生物效应[4]。治疗性糖蛋白药物的糖组成通常是决定它的药理学性质的主要部分,这些性质包括[5]:211 生物学活性

糖基对于建立或者维持糖蛋白空间结构的完整性起非常重要的作用,它们能增强热力学稳定性,保护免受蛋白酶的降解作用,增加溶解性,抑制蛋白的聚集作用。糖基化参与调节蛋白-蛋白相互作用,与发展和最优化治疗性蛋白密切相关。

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