实验九__总RNA的提取

总RNA的提

实验九 总RNA的提取、定量与RT-PCR

一、总RNA的提取与定量

目的：

从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5 g RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离

。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting。

核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA和RNA浓度为40μg/ml，单链寡核苷酸的含量为33μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

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仪器和主要试剂：

1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管

2. Trizol试剂

3. 氯仿

4. 异丙醇

5. 75℅乙醇

6. 无RNase的水或0.5℅SDS (溶液均需用DEPC处理过的水配制)

实验方法：

（一）RNA提取

1. 匀浆处理:

a.组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10℅。

b.单层培养细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c.细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×10动物、植物、酵母细胞或1×10细菌细胞加入1ml Trizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)

2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8 ℃ 10000×g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min。

(注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。)

5. 2-8℃10000×g离心15 min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60℅。

6. 把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10 min。

7. 2-8℃10000g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500g离心5 min，弃上清。

9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。加入25-200 l无RNase的水，-70℃保存。 67

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（二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度

1. 紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。

2. 取RNA样品5μl，用水稀释50~100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。

3. 在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1 OD单位的单链RNA = 40μg/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓度和产量。

4. 若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。

注意事项：

1. 从少量样品（1-10mg组织或10-10细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加1ml Trizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10 g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后加氯仿之前样品可在-60～-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5--20℃一年以上。

3. 预期产量：1mg组织或1×10细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10 g，肾3-4 g，骨骼肌和脑组织1-1.5 g，胎盘1-4 g，上皮细胞8-15 g，成纤维细胞5-7 g。

4. 蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml Trizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L NaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

5. 预防RNase污染措施：

1)

2)

3) 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 RNA在Trizol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含624RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/L NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

4)

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